[摘要]目的：探索人毛细血管瘤裸鼠移植瘤模型建立的条件。方法：将体外培养的血管瘤内皮细胞通过注射的方式植入裸鼠(BALB/c nude mice)皮下，测量不同生长时期瘤体体积变化，观察至60天后进行病理学光镜检查，并通过血管内皮细胞单克隆抗体CD31、细胞增殖标记抗体Ki-67免疫组化染色研究所成瘤体的同源性及增殖活性。结果：通过皮下植入血管瘤内皮细胞的方法成功建立了人血管瘤裸鼠动物模型，所成瘤体与原血管瘤生物学特点相似。结论：皮下植入人血管瘤内皮细胞的裸鼠动物模型建模方法可靠，能较真实地反映人血管瘤的发展过程，是研究血管瘤的较理想的平台。
[关键词]血管瘤；裸鼠；动物模型
[中图分类号]Q813[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）07-1012-03
Establishment of the hemangioma model in nude mice by means of cell suspension inoculation
HU Xiao-yi1,YANG Zhuang-qun1,SONG Yong1,TU Jun-bo1,MA Jian-ming2,XU Quan3,LI Peng3
(1.Department of Oral and Maxillary Plastic Surgery,Stomatological Hospital, Xi"an Jiaotong University,Xi"an 710004,Shaanxi,China；2.Department of Stomatology, the Affiliated Hospital of Qinghai University, Xining 810000, Qinghai, China；3.Department of Pediatric Surgery, the Second Hospital of Xi"an Jiaotong University, Xi"an 710004, Shaanxi, China)
Abstract:ObjectiveTo establish the human hemangioma model in nude mice.Methods Human hemangioma endothelial cells cultured in vitro were injected hypodermically into nude mice(BALB/c nude mice). The volume of in the transplanted tumor was measured in 60 days. Samples were taken from survival tumor and stained immunohistochemically by CD31 and Ki-67 before subjected to histopathological examination.ResultsHemangioma model were successfully established in nude mice and the original tumor histological characters were retained in the transplanted tumor.ConclusionHemangioma model established in nude mice by hypodermically injection with human hemangioma endothelial cells retains all the biological characteristics of the human hemangioma and can be a good model for research on hemangioma.
Key words: hemangioma;nude mice;disease model
血管瘤是婴幼儿常见的良性肿瘤，在新生儿的发病率为1.1％～2.6％，1岁时的发病率高达10％。其中，35％～60％发生在头颈部[1]。血管瘤的治疗方法多样，可通过激素、激光、手术等治疗，但特殊类型和特殊部位的血管瘤则一直是临床处理的难题。虽然血管瘤有自行消退现象，但也有部分不能消退者。由于对血管瘤生物学特性认识不清，尚难以发现其规律，特别是血管瘤动物模型的缺乏，严重限制了对血管瘤的研究。因而建立一种相似性好的人血管瘤动物模型对于探求其生物学特性具有重大意义。本研究在体外成功培养婴幼儿血管瘤内皮细胞基础上[2]，将其植入裸鼠皮下，生长成瘤建立裸鼠血管瘤动物模型，并探讨其生物学特性。
1材料和方法
1.1 动物模型的建立：选择BALB/c nu/nu裸小鼠16只，雌雄不限，鼠龄（32.2±3.2）天，体重（18.5±2.1）g，由第四军医大学实验动物中心提供及饲养。将体外培养的人血管瘤内皮细胞浓集，达到约1×108个/ml，然后用注射器植入16只裸鼠腹部双侧皮下组织内，每处约0.2ml，每只2处，共32处。植入完成后自然生长，每周定期观察移植瘤生长情况。于移植后第7、30、45、60天用游标卡尺测量肿瘤最大直径 a 及横径 b，根据公式V=π/6×a×b2估算肿瘤体积变化，于第60天取每个标本送病理检查及检测血管内皮细胞抗原CD31、细胞增殖核抗原Ki-67。
1.2 CD31免疫组化检测及阳性细胞计数：将肿瘤组织蜡块切片，同时取移植瘤所在裸鼠的皮下组织包埋、固定、切片。作鼠抗人CD31单克隆抗体标记，抗体由西安华美生物技术有限公司提供。以裸鼠肌肉组织切片的CD31标记为阴性对照，行移植瘤切片CD31免疫组化的阳性细胞计数，计算每个瘤组织CD31的阳性指数。每张切片在400倍光学显微镜下随机选取10个视野，每个视野统计100个细胞中的阳性细胞数，其总数除以10，再乘100%，即为其阳性指数。
1.3 Ki-67免疫组化检测及阳性细胞计数：将肿瘤组织蜡块切片，作Ki-67免疫组化检测，同时以裸鼠肌肉组织切片的Ki-67标记为阴性对照，同CD31法计算阳性指数。检测结果用SPSS11.0软件行统计学分析t检验。
2结果
2.1 裸鼠及移植瘤的生长特点：饲养60天，所有裸鼠均健康存活，成瘤率为100％。所形成的瘤体颜色呈紫红色，质地中等偏软。处死后切除瘤体送病理检查前见瘤体与周围组织界限清楚，并可见较多血管深入包膜内。观察期间肿瘤体积成逐渐增长趋势，1个月内增长速度相对缓慢，而1个月后增长速度明显加快，大体生长情况见图1，肿瘤体积增长数据见表1。
2.2 光镜下组织形态学观察：镜下可见典型的血管瘤组织表现：内皮细胞增生活跃，形成团块状，偶见核分裂。可见毛细血管腔较密集，部分管腔被阻塞，呈裂隙状(图2)。
2.3 免疫组化检测：CD31在存活移植瘤中呈强阳性表达，阳性指数42.33±3.10，作为对照的裸鼠肌肉组织内为阴性。移植瘤中Ki-67表达的阳性指数为18.25±3.20，与裸鼠肌肉组织的Ki-67阳性指数1.85±0.46相比，具有显著差异性(P＜0.01) (图3、图4)。
3讨论
20世纪80年代以前，国内外对脉管性疾病的分类、诊断比较混乱，统称为血管瘤，以至于在治疗上常常因“治疗过渡”而带来许多后遗症或者因“治疗不足”而贻误时机。1982 年Mulliken 和Glowacki 根据脉管病变的临床表现、血管内皮细胞的组织病理学特点及生物学特性，将其分为真性血管瘤(hemangioma)和脉管畸形( vascular malformations)，该分类系统有利于这类疾病的临床诊断、治疗，以及预后的评估，1996 年被国际脉管病变研究协会(ISSVA)所采纳，本研究的目的在于建立真性血管瘤动物模型。
在血管瘤的研究中，有学者使用低等动物的血窦样器官模仿血管瘤结构，进行治疗方面的研究，如用鸡冠建立毛细血管模型，研究激光的治疗作用，用鼠脾作为海绵状血管瘤的模型，研究硬化剂的治疗作用。这些研究均不能真正地反映在活体内血管瘤生长发育的真实情况和规律。近年来，制作血管瘤动物模型成为研究血管瘤的一种理想方法。国外学者已成功利用多瘤病毒转录或基因表达建立起鼠的血管瘤或血管内皮瘤模型，甚至已形成特定的细胞系载瘤免疫缺陷鼠[3-9]，但其建立的血管瘤裸鼠表现出恶性内皮细胞瘤特点，进一步导致鼠的死亡。也有学者使用具有致瘤性的F-2鼠血管内皮细胞系建立动物模型，但其诱导的肿瘤模型，只能用于研究血管性肿瘤的生物学行为。目前已知的血管瘤动物模型的建立方法中，较为成功的是将血管瘤体以组织块的方式植入裸小鼠皮下，逐渐生长形成瘤体，所形成的移植瘤与体内正式血管瘤相似性较好[10]。
裸小鼠为免疫缺陷鼠，是建立肿瘤动物模型常用的动物。常用的建模方法主要有三种：药物诱变法；细胞移植法；组织块移植法。血管瘤是人体的良性肿瘤，目前尚未见利用药物诱变方法成功建模的文献报道。组织块法建立模型时通常需要新鲜的无污染的标本，要求瘤体在增殖期，且无硬化剂等其它治疗史，往往不能及时获得理想的标本，特别是需要建立大量模型时。细胞移植的方法建模，则相对简单易行。选择合适标本体外培养出血管瘤内皮细胞，根据建模需要的量进行传代并浓集后行皮下植入。所培养的血管瘤内皮细胞可冻存，在需要时复苏后使用。
本研究采用体外培养的血管瘤内皮细胞，以注射皮下的方式植入裸鼠(BALB/c nude mice)，形成移植瘤，最终成功建立了相似性较好的血管瘤裸鼠动物模型。光镜下移植瘤的组织形态表现同人体血管瘤细胞相似。血管瘤是由内皮细胞克隆性增殖形成的良性肿瘤，有早期快速增殖和后期缓慢自然消退的特点。血管瘤内的内皮细胞虽为肿瘤性，增殖期增殖活性较强，但分化较为成熟，成熟血管内皮细胞的标志物(Ⅷ因子相关抗原、CD31等[11-12])在血管瘤中大多数有表达。本实验用鼠抗人CD31单克隆抗体检测移植瘤组织，结果呈强阳性表达，而作为对照的裸鼠肌肉组织则为阴性，表明其内皮细胞来源于人而非裸鼠。血管内皮细胞过度增殖是血管瘤组织病理学的重要形态表现，它有别于血管畸形组织中血管内皮细胞的成熟状态，又能借以观察血管瘤增生、退化进程。Ki-67是一种贯穿表达于增殖期细胞的核抗原，可作为衡量细胞增殖状态的客观指标。其表达增高，表明内皮细胞增殖活性高，内皮细胞处于高增殖状态，其表达降低，表明内皮细胞增殖活性低。本实验所测移植瘤Ki-67的表达明显高于裸鼠肌肉组织，说明其有较强的增殖活性，符合增殖期血管瘤的特点。移植后及生长过程中未添加雌激素等其它干预因素。因此，所得到的移植瘤生物学特性同正常人体增殖期血管瘤生物学特性相似，该模型可成为动态研究血管瘤的较理想的平台。
建立一种肿瘤动物模型的最终目的是为治疗等进一步研究做准备。模型相似性好是一个必备条件，同时所建立的模型应存在足够的时间方能便于进一步研究。本实验所建立的模型在60天时仍具血管瘤增殖期表现，其中在移植后第2个月内增殖明显，这便为药物筛选及药效观察等进一步研究提供了充足的时间，因而是一种较为理想的血管瘤研究动物模型。
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[收稿日期]2008-02-26[修回日期]2008-06-22
编辑/张惠娟