[摘要]目的:本研究拟观察NF-κB信号传导通路关键基因p65在人难愈合创面肉芽组织、不同时间阶段的增生性瘢痕以及正常皮肤标本的表达水平是否存在差异及关系。方法:收集临床标本40例为实验组,其中难愈合创面肉芽组织(A组)、半年内增生性瘢痕(B组)、半年至1年增生性瘢痕(C组)、一年以上增生性瘢痕(D组)组织各10例,收集正常皮肤组织标本8例为对照组(E组)。采用组织免疫化学方法、实时荧光定量RT-PCR和Western blot技术分析检测各标本中NF-κB p65表达。结果:免疫组化SP法染色B、C、D组中表达阳性,尤其是在B组中皮肤基底细胞层细胞阳性表达尤为明显。RT-PCR检测中,各组间均无显著的统计学意义(P>0.05)。但从各组均数来看,B、C、D组处于较高水平(B组为0.44,C组为0.46,D组为0.47),数值相近,并且有高于E组和A组的趋势(A组为0.38,E组为0.30)。Western blot 检测中B、C、D组的蛋白表达水平明显要高于A组和E组(P0.05). However,Groups B,C,D are similar,and there is higher than that of Group E and Group A. Western blot test results NF-кB p65 in B group,C group,D group of protein expression levels were significantly higher than that of group A and E group (P Key words: hypertrophic scars; NF-kappa B; apoptosis; chronic granulation tissue
NF-κB信号转导通路贯穿于创伤修复与愈合的整个生物学过程。NF-k B存在于几乎所有类型的组织和细胞,是一类关键性的核转录因子,是由Rel/NF-kappaB家族的多肽成员所形成的一组二聚体形式的转录因子的统称,因能与B细胞免疫球蛋白κ轻链基因的增强子序列的B点位特异结合而得名[1]。以p50/p65异源二聚体最先确认并最常见。NF-κB是一种具有多向性调节作用的转录因子,活化后通过调节许多细胞因子、趋化因子、生长因子、粘附分子及多种酶的基因表达,对细胞内许多基因的表达起着关键性的调控作用,参与细胞生长、发育、凋亡等多种生理功能,并在细胞恶性转化、纤维化等方面起重要作用[2-3]。越来越多的研究表明许多疾病的发生和发展都与NF-κB的过度活化有关。而NF-κB中p65表达将阻止凋亡并提高TRAIL治疗细胞中的NF-кB的活性。许多抗肿瘤药物因能使NF-κB活化而使得许多肿瘤细胞产生药物抗性[4-5]。
1材料和方法
1.1 实验材料及标本采集、处理及分组:收集山东大学附属省立医院烧伤整形美容外科手术切除的难愈合创面肉芽组织及增生性瘢痕组织40例以及正常皮肤8例,年龄2～42岁,平均22.7±10.60岁,其中女性15例,男性33例。其中,难愈合创面肉芽组织及增生性瘢痕病因如下:火焰烧伤为12例,热液烧伤为10例,化学烧伤为7例,外伤为6例,其它5例。难愈合创面肉芽组织为上述原因导致1～2个月尚未愈合的创面10例。增生性瘢痕位于面颈部5例、躯干10例,上肢8例,下肢7例。3～6个月内增生性瘢痕10例,0.5～1年增生性瘢痕10例,1～3年增生性瘢痕10例。临床收集标本,每份标本分为两部分,分别用于病理免疫组化检测和转录、翻译水平等检测,组织保存于液氮。
实验分组情况,难愈合创面肉芽组织为A组,半年内增生性瘢痕为B组,半年至1年增生性瘢痕为C组,1年以上增生性瘢痕为D组,对照组正常皮肤组为E组。
1.2 主要试剂:硝酸纤维素杂交膜:S&S公司产品,1kb DNA Marker:MBI,丙烯酰胺(上海生工生物工程公司),1g N,N"-亚甲双丙烯酰胺(Promega公司产品),NF-κB p65 兔单克隆抗体购自美国Cell Signaling 技术公司、酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体)购自北京中山金桥(美国SantaCruz Biotechnology, INC)。
1.3 常规HE、免疫组化染色:常规HE染色:取材组织块,经固定后,常规石蜡包埋,4μm切片,脱蜡,染液染色,封片。免疫组织化学染色S-P法:4μm的组织切片脱蜡、水化;3%双氧水室温孵育;蒸馏水洗;PBS洗;正常血清(1:10)湿盒孵育;滴加一抗,置湿盒中室温孵育;PBS洗;滴加生物素标记的二抗工作液置湿盒孵育;PBS洗;滴加链霉亲和素过氧化物酶复合物工作液室温孵育;PBS洗;DAB显色5～10min,在显微镜下掌握染色程度;再水洗复染脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、镜检。
1.4 RT-PCR检测NF-κB p65mRNA表达:根据文献[6],设计合成NF-κB p65及内参照β-actin的引物各一对,序列如下:
NF-κB p65上游引物P1:5"-TGCTGTGCGGCTCTGCTTCC-3"
下游引物P2:5"-AGGCTGGGGTCTGCGTAGGG-3;
β-actin 上游引物P1:5"-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3"
下游引物P2:5′-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC -3′。
扩增的片段分别为321bp和539bp。上述引物均由美国Invitrogen生物公司合成。
首先对实验所用物品去Rnase处理。再对各样本组织标本的组织及细胞总RNA进行提取,然后进行逆转录(RT)反应和聚合酶链反应(PCR)。RT反应条件如下:快速离心混匀;37℃ 1h,95℃ 10min灭活M-MLV;快速离心使蒸汽沉于管底。PCR反应条件快速离心混匀;95℃ 5min,冰浴冷却,然后快速离心使蒸汽沉于管底。加入1μl(1U/μl) Taq DNA聚合酶,快速离心混匀,加入30μl液体石蜡。循环条件:94℃ 1min;58℃ 1min;72℃ 1min;共35个循环,最后72℃延长7min。电泳鉴定。
将凝胶电泳图像输入美国Kodak凝胶分析系统,应用1D Image Analysis Software进行表达强度分析,按下公式计算相对系数。相对系数=细胞因子表达强度/-actin表达强度。
1.5 Western blot检测NF-κB p65蛋白表达:本试验应用蛋白提取液(含蛋白酶抑制剂10%)抽提各个实验组织的总蛋白,可以有效抑制蛋白降解。应用蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳方法及Western Blot方法。将SDS-PAGE凝胶电泳完毕,小心取下凝胶,转膜,洗膜后,将NC膜置于平皿或小袋中,加入适当稀释的一抗(兔抗人MICA多抗),再洗膜;加入适当稀释的酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体),再洗膜后显色,直至显色效果满意为止,立即将膜置于双蒸水中终止反应。
1.6 统计学分析:全部实验数据均采用SPSS13.0医学统计学软件进行分析,各组样本的凋亡水平均以均数±标准差(x ±s)。多组均数比较进行一维方差分析(One way ANOVA), P 2.2 免疫组化SP法检测NF-κB p65表达及分布
2.2.1 NF-кB p65正常时主要位于细胞浆,当激活时转移至细胞核才能发挥其生物学作用。E组可见正常皮肤表现为表皮基底层、成纤维细胞细胞浆呈淡黄色,细胞核无黄染,在细胞上基底层,部分细胞核内出现黄染成纤维细胞基本无阳性表现,呈细长,背景清晰无非特异性着色。组织中胶原纤维无着色(图2-1)。
2.2.2 A组可见成纤维细胞偶见阳性表现,呈圆形,背景清晰无非特异性着色。组织中胶原纤维无着色(图2-2)。
2.2.3 B组可见成纤维细胞均匀着色的棕黄色颗粒,较多,呈圆形,背景清晰无非特异性着色。组织中胶原纤维无着色(图2-3)。
2.2.4 C组可见细胞阳性率下降,纤维细胞仍有着色,蓝色核染增多,背景清晰无非特异性着色。而细胞减少,瘢痕组织中大量胶原纤维无着色(图2-4)。
2.2.5 D组可见细胞阳性率偶见,成熟的纤维细胞胞浆内未见棕黄色颗粒,呈细长,背景清晰无非特异性着色。组织中胶原纤维无着色(图2-5)。
尤其注意的是在瘢痕增生早期组织中,可见表皮鳞状细胞层菲薄,而在瘢痕皮肤基底细胞层细胞有大量均匀着色的棕黄色颗粒,而相比较在皮肤其它各层却鲜见(图3)。
2.3 RT-PCR检测组织NF-кBp65的表达:NF-кB p65活性水平各组间比较差异无显著的统计学意义(P>0.05)。(表1,图4)。但从各组均数来看,E组和A组处于较低水平(A组为0.38,E组为0.30)。B、C、D组处于较高水平(B组为0.44,C组为0.46,D组为0.47),数值相近,并且有高于E组和A组的趋势。
2.4 Western blot检测NF-кBp65的表达:NF-кB p65在A组和E组中蛋白表达水平差异没有显著地统计学意义(P>0.05),B组、C组、D组的蛋白表达水平明显要高于A组和E组(P