吴 宇 综述，张培华 审校
（广东医科大学 广东医科大学附属医院整形外科 广东 湛江 524000）
胶原蛋白是由两条α1多肽链和一条α2多肽链组成的三螺旋结构蛋白。其不同的空间结构具有不同的生物学性能，目前按照结构功能分类归纳出29种胶原蛋白[1-2]。胶原蛋白具有良好的表面活性，可乳化或形成泡沫，也可形成膜、海绵或凝胶等,同时其具有良好的组织相容性、生物降解安全性、凝血性等生物学活性，且低毒、抗原性弱，能诱导细胞生长、促进创伤修复[3]。近数十年来，随着生物科技、材料科学等日益进步，创面修复已日渐摒弃传统敷料，而在新型敷料中，生物型敷料因其类似于人体细胞外基质，与人体组织相容而备受推崇，胶原蛋白已逐步被广泛应用[4]。目前,市面上大多数胶原蛋白修复材料是由陆生哺乳动物（如牛和猪）毛皮、肌腱等部位所提取的胶原蛋白制成。然而，近数十年来动物传人传染病如牛海绵状脑病等的爆发，增加了人们对使用陆生哺乳动物来源产品而致病的担忧，尽管Koutsoumanis等基于目前规例建立假设模型，估计即使使用感染动物皮肤、骨骼作为加工材料来生产明胶或胶原，也几乎肯定不会导致疾病传播[4]。但由于宗教信仰和地方风俗的制约，也限制了陆生动物胶原的应用：如印度教禁用牛源性蛋白，伊斯兰文化不使用猪源性蛋白[5-6]。此外，陆生胶原蛋白在不改变结构情况下去除潜在的免疫源性成分非常具有挑战性[7]。临床上应用陆生胶原蛋白修复创面，虽然可促进愈合，但不能诱导创面上皮化，后期仍需植皮。因此，利用来源充足、提取成本低且不涉及宗教文化限制的海洋生物替代陆生哺乳动物作为胶原蛋白来源，制作抗原性更弱、组织相容性更好和生物学活性更高的修复材料日渐成为新兴的热门话题[8]。
水母体内胶原蛋白约占其总蛋白量的一半[9]。Paradiso等[10-11]证实水母的胶原蛋白与哺乳动物的胶原蛋白结构相似，但脯氨酸和羟脯氨酸含量较哺乳动物胶原蛋白含量低。Cheng等提取的水母胶原蛋白氨基酸组成与小牛皮肤胶原相似[12],并把它归类为Ⅰ型胶原蛋白，但与传统Ⅰ型胶原蛋白有轻微结构差异。同时，水母来源的胶原蛋白也被证实与哺乳动物Ⅰ型胶原蛋白有着相似的生物学性能[13]。此外，因过度捕捞、沿海地区富营养化、和气候变化引起水母这种“有害生物”全球范围增长的问题也亟待解决[1]。本文就利用水母提取胶原蛋白并交联改性，及其在创伤修复领域的研究作一综述。
水母含水量超过95%，灰质成分中无机盐含量高，有机物占比受水分及无机盐影响。基质中胶原蛋白三螺旋结构与非胶原蛋白交联，导致其低温条件下水溶性弱[14]。目前，在大多数研究领域，水母的胶原蛋白提取方法一般采用冻干、超声等物理辅助,利用化学溶剂溶解的酸法、碱法等,利用酶在合适温度、pH下的酶提取法。物理因素常用于增加水母胶原蛋白的提取率,低温条件下应用酸法或酶法也利于保持肽链的完整性[15]。弱酸处理使胶原分子间非共价键断裂[16]，但胶原末端非螺旋结构与非胶原蛋白间存在很强的共价交联，难以单独被弱酸裂解。Khong运用超声辅助的酸法处理水母，其胶原蛋白的提取率约为传统酸法的7倍[17]。Aziz用NaOH溶液提取水母胶原蛋白，提取时间长达48 h，但实验未分析所提取胶原蛋白的分子结构[18]。酶法提取目前较为常用[1]，利用胃蛋白酶水解除胶原蛋白三螺旋结构外的大多数基质蛋白，准确切断端肽而不影响主链结构。酶法提取的关键[12]：①水母基质水分占比大，影响胶原蛋白的溶解，提取前将其均质、冻干可增加胶原蛋白提取率，根据冻干的干重，赤月水母胶原蛋白提取率为35.2%；
②酸性环境下酶作用时间过长会导致胶原蛋白分解[16]，因此提取完毕后尽快将粗提液置于弱碱溶液透析，失活胃蛋白酶。尽管提取方法各异[17]，但总体致力于最大限度地保留胶原蛋白结构完整和其良好的生物学活性，并不断提高提取率。Fernandez等从水母基质有类似于人体真皮的组分和结构出发，从水母体直接去除实质细胞，保留细胞外基质成分，冻干后用作为支架培养细胞，结果显示此支架能有效促进细胞增殖和迁移[19]。此实验方法也为有效利用水母胶原提供探索思路。
由于羟脯氨酸等亚氨基酸含量低及分子间交联程度弱，水母胶原蛋白机械强度、降解速率等逊于牛、猪等哺乳动物胶原，变性温度也低于正常人体生理温度[20]。提取过程破坏其天然交联结构，提取后胶原的机械强度和热稳定性较天然状态弱[21]。外源性交联促进胶原蛋白肽链相互结合，从而增加其张力强度并降低其延展性，使蛋白结构在热力作用下亦能保持稳定[22]。交联也可封闭主链上蛋白酶识别位点，有效防止胶原被蛋白酶水解。交联还可覆盖蛋白链上抗原表位，降低其免疫源性。常用交联有物理、化学和生物交联等。物理交联通过产生高反应性自由基作用于胶原主链而促进相邻的纤维交联，方法简单，产物安全、无毒害，但放射、热力等因素长时作用可能会导致胶原变性而抵消其稳定作用[21]。Carvalho等根据各组分离子相互作用原理，将水母胶原、壳聚糖与岩藻多糖按不同比例混合后用冻干法制备晶胶，制备的晶胶具有多孔结构和细胞相容性，随胶原浓度提高，其机械性能和弹性模量增加，即使置于37℃体外环境下培养细胞，干胶结构与性能均无明显变化[23]。化学交联应用外源性交联剂与胶原链上特异基团发生反应而促进胶原链相互聚合，交联剂性质决定交联后支架特性[24]。传统交联剂因其交联后残留和细胞毒性，已日渐被其无毒衍生物和天然交联剂所替代：Addad等用EDC（碳二亚胺）与肺水母胶原进行交联，当EDC与胶原按1∶7混合时，胶原蛋白变性温度从单体的28.9℃上升至33℃[13]。化学交联的交联程度高且均匀，目前在生物科技领域应用最广。生物交联是胶原基质形成的天然方式，酶催化主链上某些基团发生修饰反应，从而促进蛋白链相互结合，优点明显但价格昂贵，随着生物技术日益发展，这种具有反应动力学精确和特异性良好的交联方式将会被开发利用[21]。
组织、器官损伤会引起局部血管破裂出血，严重创伤导致失血性休克，危及生命，首要治疗措施为止血、抗休克[25]。同时，因组织结构持续破坏、微循环障碍，或病原微生物入侵等诱发炎症反应，非特异性炎可清除坏死组织、杀灭病原，但持续的炎症反应会抑制创面愈合[26]。除了不能控制的炎症会导致创面无法愈合，同样不受控制的基质沉积会导致瘢痕增生[27]。随着老龄化、代谢紊乱和血管异常等相关疾病的增加，创伤修复日益加重全球医疗系统的负担，为了解决这一问题，新型修复材料的研究受到广泛瞩目，根据伤口的复杂性设计出不同的形态和性能的材料促进愈合是创伤修复研究的热点[28]。以下总结水母胶原蛋白促进创伤修复的研究进展，为今后的科学探索提供参考。
3.1 止血性能：胶原蛋白海绵具有高度的吸水性能，可充分吸收创面血液；
同时胶原蛋白内富含氨基酸和血小板特异性结合位点，可诱导血细胞和血小板黏附，模拟内源性凝血途径而有效止血；
胶原蛋白还具有良好的组织相容性，有效止血几周后可被组织吸收，应用非常方便[29]。目前，有部分陆生动物胶原止血敷料应用于临床，其表面可负载凝血因子、纤维蛋白原和凝血酶等活性因子，止血效果迅速，疗效及安全性也受到外科医生的认同[30]。Cheng等从水母中胶层提取Ⅰ型胶原，冻干后与EDC交联，制备的胶原海绵不仅具有良好的理化性能，且能快速吸收血液并促进血小板和血细胞黏附、聚集；
随着胶原蛋白浓度的增加，海绵的吸水性能和止血性能增强，动物实验也证实此胶原海绵比纱布的止血性能更好，因此可应用为止血剂和创伤敷料[12]。
3.2 皮肤创面修复：皮肤是人体最外层、面积最大的器官，是机体的第一道防线[31]。当皮肤创面正常愈合过程受全身及局部多种不利因素影响时（如：代谢异常、免疫抑制或放射等）,会导致创面愈合时间延长或不愈合[32]。外源性胶原蛋白可替代创面胶原结合基质金属蛋白酶及弹性蛋白酶，抑制其活性，并保护创面生长因子[33]；
外源性胶原也可增加创面抗炎因子的合成与表达，降低炎症反应，加快创面上皮化[27]；
外源性胶原还可诱导真皮下毛细血管生长，促进成纤维细胞增生和肉芽组织形成，加速创面愈合；
胶原海绵多孔结构也可吸收创面渗液[34]，为细胞生长提供适宜的湿润微环境，促进细胞的增殖和分化[28]。
在探索水母胶原蛋白促进皮肤创面愈合的研究中，已有研究证实其具有组织相容、促细胞生长等生物学特征，可应用为创伤敷料或组织工程材料促进修复，具体如下：①良好的皮肤组织相容性[35]：Widdowson将水母胶原蛋白的皮肤组织相容性与牛胶原蛋白进行比较，发现交联或非交联水母胶原的宿主耐受程度与牛胶原相当，且水母胶原还具有良好的可吸收性；
②水母胶原水解肽促细胞迁移作用：Sumiyoshi等用水母胶原与猪胶原混合制备膜、海绵双层皮肤敷料，用于修复全层皮肤缺损，其膜层能引起角质形成细胞迁移而加速上皮化，海绵层能促进成纤维细胞与炎症细胞浸润，加速肉芽组织形成；
机理除了水溶性水母胶原蛋白贴敷创面后溶解，扩大了猪胶原纤维空间利于细胞迁移外，还与水母胶原降解后形成短肽或释放的活性分子促细胞迁移有关[36]；
③水母胶原在皮肤组织工程中的应用：胶原蛋白可单用或作为天然支架培养表皮细胞、成纤维细胞等，也可负载药物或活性因子后移植于皮肤创面促进修复[15]，又或制备成胶原膜等修复全层皮肤缺损[37]。Fernandez等通过脱细胞作用直接从水母体去除实质细胞制备皮肤组织工程支架，该支架保留水母细胞外基质结构和成分，红外光谱显示该脱细胞制备的支架为Ⅰ型胶原蛋白，人皮肤成纤维细胞在支架上培养7 d后仍能良好地黏附和增殖，因此，该仿生支架可模拟人类皮肤，为皮肤组织工程提供了巨大的应用潜力[19]。
3.3 骨缺损修复：骨骼是人体运动系统的重要器官，负责机体的各种活动。因创伤、感染、肿瘤切除等因素造成的骨质大量缺损会导致运动功能障碍并严重影响患者的生活质量及社会职能。用于填充修复骨质缺陷的外源性胶原不仅可以促进骨细胞分化、增殖，其降解产物也可为成骨细胞提供营养支持，其中水母胶原蛋白是新兴的研究材料。Alkildani等[38]发现水母胶原蛋白制备的3D支架有利于促进成骨细胞的黏附和细胞活力保持。Flaig等[8]用水母胶原蛋白制备支架修复小鼠颅骨缺损，结果显示水母胶原的免疫原性不仅比传统胶原蛋白（猪心包胶原）弱，且更利于诱导巨噬细胞向促修复亚型转化，促进植入床血管形成，因而具有良好的促进骨组织修复潜能。由于天然胶原机械性能不足，易被胶原酶降解，因此常联合矿物质来增加其理化性能和作用效应。Arslan等[39]利用水母胶原蛋白、人发角质蛋白与蛋壳来源的纳米羟基磷灰石交联制备骨诱导生物材料支架，实验结果显示该支架呈均质、多孔的三维结构，无细胞毒副作用，且具有热力学稳定，并能诱导脂肪干细胞向成骨分化，因此这种复合支架适合用于骨质缺陷的修复。
3.4 软骨缺损修复：软骨组织损伤也是临床常见的创伤。软骨缺乏血管、神经滋养且软骨组织再生能力弱，软骨修复具有非常大的挑战性。在体外构建机械性能优越、可维持软骨细胞表型或能诱导干细胞向软骨分化的支架负载软骨细胞或干细胞修复缺损软骨是软骨组织工程的主要研究方向。水母胶原蛋白是良好的软骨组织工程修复材料，Sewing等发现利用水母胶原蛋白作为支架培养软骨细胞，软骨细胞能维持细胞表型而不产生去分化，软骨细胞的Ⅱ型胶原蛋白在mRNA和蛋白水平上高表达和细胞增殖率低[40]。此外，软骨细胞提取困难，有学者寻求用不同来源的干细胞分化成软骨细胞，而水母胶原蛋白成为多种干细胞软骨分化的合适载体。Hoyer等[41]用水母胶原蛋白纺丝制备软骨组织工程支架，制备的支架与软骨细胞外基质相似，支架不仅无细胞毒性，且可为间充质干细向软骨分化提供合适的载体。Pustlauk等[42]利用多孔且有一定机械强度的水母胶原蛋白与海藻酸盐水凝胶混合制备软骨修复支架，水凝胶赋予复合结构弹性，同时水凝胶与胶原蛋白结合后力学性能得到加强，混合支架能在新软骨基质形成前保持机械稳定；
该支架支持间充质干细胞向软骨细胞分化，促进软骨分化标志物基因的表达，非常适合用于干细胞经体外培养分化后的软骨修复。
3.5 免疫调节及抗微生物作用：创伤后机体免疫力下降，病原容易入侵而引发感染。增强机体免疫力能有效降低感染风险，加速创伤愈合。水母胶原及其水解胶原肽能提高机体免疫力，有效防止因创伤而诱发的感染。实验表明大量的紫外线照射除了会引起皮肤光老化和损伤，也会抑制机体免疫力，继而诱发创伤后皮肤感染，Fan等[43]利用水母胶原及其水解胶原肽喂养紫外线照射引发损伤的小鼠，结果显示无论口服胶原或者水解胶原肽，均能有效维持机体免疫力，从而避免诱发致命性感染。Morishige等[44]发现口服越前水母的水解胶原肽，无论在转录还是在合成分泌阶段，均促进免疫器官淋巴细胞内免疫球蛋白IgA、IgG、IgM和细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL4等的转录与合成，增加血清抗体含量，从而能有效增强机体免疫力而不诱发过敏反应。Putra等[45]对此机理进行探索，发现越前水母胶原的免疫刺激作用系通过TLR4信号路径活化NF-kB转录因子和JNK蛋白激酶实现的。除了免疫调节作用，Ovchinnikova等[46]从海月水母中提取出一种含40个氨基酸残基、分子量约4.29 kDa的抗菌肽，这种活性肽类似于传统防御素，并能有效地对抗革兰氏阳性与阴性菌。目前，水母胶原蛋白免疫调节作用大多数通过系统作用，其局部抗微生物作用仍有待深入探索。
3.6 口服水母胶原的抗氧化和促进创面愈合作用：反应性氧自由基积聚有利于对抗创面感染,但过多氧自由基积聚却抑制创面愈合，而口服有抗氧化活性的胶原肽可清除自由基，加速创面愈合。低分子量的水母胶原肽（＜3kDa）是一种抗氧化剂，有良好的自由基清除作用[47]。实验表明无论口服水母胶原或其水解小分子肽均可促进创面愈合，Assaw等用水母胶原喂养构建背部创面的SD大鼠，检测其促创面愈合能力，结果显示水母胶原蛋白不仅具有抗氧化活性，且口服后能有效促进创面收缩，增加创面胶原蛋白沉积，并减少愈合后瘢痕增生[48]。口服胶原水解小分子肽也具有同样作用，Felician用胶原酶Ⅱ、木瓜酶结合碱性蛋白酶分别降解水母胶原产生两种不同分子结构、分子量均小于25Kda的胶原肽，体外实验显示经胶原肽处理的人脐静脉内皮细胞迁移能力增强，体内实验也证实胶原肽能有效促进创面收缩、胶原沉积及上皮化，再生组织的β-FGF、TGF-β1表达增强[49]。
本文总结了水母胶原蛋白的提取及交联改性的关键要素，以及在创伤修复领域的研究进展，包括其止血性能、皮肤修复、骨软骨修复、口服促愈合作用及其防御微生物感染等功能。水母胶原蛋白具有良好的表面活性，冷冻干燥形成的多孔海绵结构依靠其高度的吸水性能，快速吸收血液并促进血小板和血细胞在胶原海绵内聚集，模拟生理性血液凝固而具有止血性能。水母胶原在皮肤组织中展现良好生物相容性，同时水母胶原水解肽也具有促上皮细胞迁移作用，可与多种生物活性材料混合，不仅增强其物理性能，还可与生物活性物质共同促进皮肤创面愈合。在骨软骨修复研究领域，水母胶原促进成骨细胞的黏附，诱导巨噬细胞向促修复亚型转化，具有良好的促骨创伤修复潜能，并能与多种生物学材料交联，诱导干细胞向成骨分化。水母胶原蛋白也可作为软骨细胞的培养支架，培养的软骨细胞能维持软骨细胞表型而不产生去分化，与海藻酸盐水凝胶混合制备支架可支持间充质干细胞向软骨细胞分化，水母胶原促成骨细胞黏附、维持软骨细胞表型，促干细胞向骨、软骨分化等特性表明其可成为良好骨、软骨修复材料。口服胶原或者水解胶原肽能促进免疫器官淋巴细胞合成和分泌IgA、IgG、IgM,TNF-α、IFN-γ、IL4等免疫因子，提高机体免疫力，避免创伤后引起的机体感染。此外，口服水母胶原蛋白及其水解肽还可促进创面收缩，增加创面胶原蛋白沉积，加速愈合过程，并减少愈合后瘢痕形成。
目前，大多数关于水母胶原促愈合作用的研究限于细胞、动物实验，其作用机制仍需要进一步明确，临床应用研究还有待深入探索。创伤修复领域对修复材料的要求越来越高，不仅要求材料具有促愈合作用，还要求材料应用后能产生良好的修复效果，或与原生组织具有一致性。单一的材料是无法实现的，而胶原蛋白则可与其他具有良好生物特性的材料构建复合支架、或作为负载生长因子与干细胞等的良好载体，日渐受到创伤修复领域研究的青睐。总而言之，随着科学技术的日益进步和社会经济的不断发展，对胶原蛋白创伤修复材料的研究将越来越深入，也将会有更多、更优质、更经济的胶原蛋白创伤修复材料应用于临床。
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