谭道富，唐友琼，宋 丹，许 诣
(1.恩施土家族苗族自治州中心医院 药剂科，湖北 恩施 445000；
2.湖北文理学院附属医院，襄阳市中心医院 儿科， 湖北 襄阳 441021)
变应性鼻炎(Allergic rhinitis，AR)即“过敏性鼻炎”，是一种常见的耳鼻喉类疾病[1]。近年来，AR发病率呈上升趋势[2]。该疾病治疗手段较为单一，且发病机制还未完全阐明，急需开发具有针对性的治疗药物缓解疾病。目前研究发现有多个因子参与调控AR，免疫功能在调控AR病情中发挥重要作用，机体接触特异性变应原并呈递抗原过程中，辅助性T细胞1(Th1)/辅助性T细胞2(Th2)介导免疫偏移及失衡，是引发AR的重要机制[3]。临床报道发现，白细胞介素-33(Interleukin-33，IL-33)可与受体-生长刺激表达基因2(Growth stimulating expressed gene 2，ST2)结合，刺激相关通路激活，促进T细胞向Th2型细胞转化，并诱导Th2型细胞产生免疫因子向鼻黏膜组织聚集，介导AR炎性疾病的产生[4-5]。推测IL-33/ST2通路在AR发生发展中起到关键作用。
中医将AR归属为“鼻鼽”范畴，且中药在AR领域的治疗有几千年历史，利用中药治疗相关疾病成为目前研究的重点[6]。本科室用“芪丹益肺通窍颗粒”治疗AR，在缓解AR患者喷嚏、鼻黏膜肿胀等症状方面，有较好的效果。且前期动物实验发现，“芪丹益肺通窍颗粒”可显著调控AR大鼠Th1/Th2免疫失衡，缓解鼻部炎症症状[7]。但其调控AR免疫失衡的具体分子生物学机制还不甚明确。本研究通过建立AR大鼠模型，探讨芪丹益肺通窍颗粒调控AR免疫失衡可能的作用机制，以期为“芪丹益肺通窍颗粒”的开放应用提供可靠资料。
1.1实验材料 清洁级SD大鼠120只，6～8周龄，雌雄不限，体重180～220 g，购自成都达硕实验动物有限公司，SCXK(川)2020-030。本院动物房中适应性饲养大鼠，试验符合3R原则，经本院伦理委员会批准。
“芪丹益肺通窍颗粒”(包括黄芪、防风、白术、牡丹皮、川芎、黄芩、肾荆芥等，成药由成都中医药大学附属医院药剂科提供)；
卵白蛋白标准品(货号：BTN90610，北京百奥莱博科技有限公司)；
HE试剂盒(货号：AR1180，武汉博士德生物工程有限公司)；
ELISA试剂盒：血清免疫球蛋白(IgE)(货号：XFFM072D，上海信帆生物科技有限公司)、白细胞介素-8(IL-8)(货号：SD11356，上海心语生物科技有限公司)、趋化因子CC基序配体2(CCL2)(货号：SRE-12169，上海赛可锐生物科技有限公司)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)(货号：CK-E10109，武汉益普生物科技有限公司)、白细胞介素(IL-2、IL-6、IL-9)(货号：qy-r0042，qy-r0040，qy-r0045，上海乔羽生物科技有限公司)；
IL-33、ST2、Th1转录因子(T-bet)、Th2转录因子(Gata3)、髓样分化蛋白88(MyD88)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)抗体均购自美国abcam公司；
CytoFLEX SRT流式细胞仪购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司。
1.2 方法
1.2.1 大鼠AR模型建立及分组给药 参照文献[7]取SD大鼠，用卵白蛋白(0.3 mg/mL，溶剂为30 mg/mL的氢氧化铝生理盐水溶液)腹腔注射1次/d、连续7 d，进行初步致敏，再用5%卵白蛋白(50 μL/只，1次/d)滴鼻进行强化致敏，若大鼠出现反复抓鼻、喷嚏、流涕现象，视为造模成功。将造模成功的大鼠随机分为模型组、中药组、pcDNA-IL-33组、pcDNA-NC组、中药+pcDNA-IL-33组，每组20只，另取20只大鼠，作为正常对照组，除腹腔注射及滴鼻溶液为氧化铝生理盐水溶液外，其余同模型组。中药组参照文献[7]设置剂量，并按成人用量的8倍给药(药物浓度2.8 g/mL，10 mL/kg给药剂量，2次/d)，pcDNA-IL-33组及pcDNA-NC组分别经尾静脉注射给予IL-33过表达重组蛋白载体及阴性对照溶液(250 μL/kg，50 μmoL/L，1次/3d)；
正常对照组及模型组灌胃给予等量生理盐水；
各组连续给药14 d，每次给药治疗结束后，用5%卵白蛋白(500 μL/kg，1次/d，共14次)进行滴鼻致敏。末次给药30 min后，参照文献[7]中大鼠行为症状评分表，对大鼠鼻部AR症状进行评分。
1.2.2 ELISA法测血清IgE、IL-8、CCL2水平 评分后麻醉各组大鼠，取腹主动脉血3 mL，离心收集上层血清，按ELISA试剂盒说明书方法检测血清IgE、IL-8、CCL2水平。
1.2.3 流式细胞术检测Th1/Th2比例 取大鼠腹主动脉血3 mL，加入等体积磷酸缓冲溶液稀释后，用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，参照文献[8]中方法，用流式细胞仪检测Th1/Th2比例。
1.2.4 鼻黏膜组织HE染色及嗜酸性粒细胞数目检测 各组随机取6只大鼠，麻醉处死，取鼻黏膜组织，置于4 %多聚甲醛中固定24 h后，透明、浸蜡、包埋后切成5 μm切片。取部分切片按HE试剂盒说明书方法染色、封片后置于光镜下拍照。光镜下可见嗜酸性粒细胞胞核为杆状或分叶状，胞浆呈鲜红色。每片随机取5个视野对嗜酸性粒细胞进行计数。
1.2.5 免疫组化法检测IL-33、ST2阳性表达 取剩余鼻黏膜石蜡切片，脱蜡、水化及抗原修复后，加入一抗(IL-33、ST2，1∶500)4 ℃孵育过夜，加入羊抗兔IgG二抗(1∶500)室温孵育50 min，苏木精复染、封片，光镜下观察拍照，用Image Pro Plus 5.0系统分析图像阳性表达的平均光密度值。
1.2.6 ELISA法检测鼻腔灌洗液中TNF-β、IL-2、IL-6、IL-9水平 各组随机取6只大鼠，麻醉后，用生理盐水灌洗鼻腔，反复灌洗收集鼻腔灌洗液，确保回收率>80%，按ELISA说明书方法检测组织TNF-β、IL-2、IL-6、IL-9水平。
1.2.7 Western blot法检测鼻黏膜组织T-bet、Gata3、IL-33、MyD88、TRAF6蛋白表达 各组剩余8只大鼠麻醉处死，取新鲜鼻黏膜组织，冰上研磨取匀浆液，用蛋白提取试剂盒及BCA法提取并测定蛋白浓度，取50 μg蛋白进行电泳、转膜，加入一抗(T-bet、Gata3、IL-33、MyD88、TRAF6(1∶1 000)、β-actin内参(1∶2 000))，4 ℃湿盒孵育过夜，加入羊抗兔二抗(1∶2 000)，37 ℃孵育4 h，增强化学发光法显色，化学发光仪观察、拍照，用Image-J软件分析蛋白表达。
2.1 各组大鼠鼻部症状评分比较 与正常对照组相比，模型组大鼠鼻部搔抓及打喷嚏次数增多，鼻黏液增多，AR鼻部症状评分升高(P<0.05)。与模型组相比，中药组大鼠AR鼻部症状评分降低(P<0.05)；
pcDNA-IL-33组大鼠AR鼻部症状评分进一步升高(P<0.05)。中药+pcDNA-IL-33组上述指标变化与中药组相反(P<0.05，见表1)。
表1 大鼠AR鼻部症状评分比较
2.2 各组大鼠血清IgE、IL-8、CCL2、TGF-β水平比较 与正常对照组相比，模型组大鼠血清IgE、IL-8、CCL2水平升高(P<0.05)。与模型组相比，中药组大鼠血清IgE、IL-8、CCL2水平降低(P<0.05)；
pcDNA-IL-33组大鼠血清IgE、IL-8、CCL2水平进一步升高(P<0.05)。中药+pcDNA-IL-33组上述指标变化与中药组相反(P<0.05，见表2)。
表2 大鼠血清IgE、IL-8、CCL2水平比较
2.3 各组大鼠外周血Th1/Th2比例比较 与正常对照组相比，模型组大鼠外周血Th1、Th1/Th2比例降低(P<0.05)，Th2比例升高(P<0.05)。与模型组相比，中药组大鼠外周血Th1、Th1/Th2比例升高(P<0.05)，Th2比例降低(P<0.05)；
pcDNA-IL-33组大鼠外周血Th1、Th1/Th2比例进一步降低(P<0.05)，Th2比例进一步升高(P<0.05)。中药+pcDNA-IL-33组上述指标变化与中药组相反(P<0.05，见表3，图1)。
表3 大鼠外周血Th1、Th2、Th1/Th2水平比较
A：正常对照组；
B：模型组；
C：中药组；
D：pcDNA-IL-33组；
E：中药+pcDNA-IL-33组；
F:pcDNA-NC组。
2.4 各组大鼠鼻黏膜组织病理变化及嗜酸性粒细胞数目比较 正常对照组鼻黏膜组织结构正常，无明显损伤。模型组大鼠可见鼻黏膜组织水肿、上皮脱落、腺体增生，嗜酸性粒细胞及淋巴细胞浸润明显，胞核为杆状或分叶状、胞浆呈鲜红色的嗜酸性粒细胞数目增多(P<0.05)。与模型组相比，中药组大鼠鼻黏膜组织水肿、上皮脱落及炎性浸润明显缓解，嗜酸性粒细胞数目减少(P<0.05)；
pcDNA-IL-33组大鼠鼻黏膜组织病理损伤进一步加重，嗜酸性粒细胞数目进一步升高(P<0.05)。中药+pcDNA-IL-33组上述指标变化与中药组相反(P<0.05，见表4，图2)。
表4 大鼠嗜酸性粒细胞数目比较
A:正常对照组;B:模型组;C:中药组;D:pcDNA-IL-33组;E:中药+pcDNA-IL-33组;F:pcDNA-NC组;×200。
2.5 各组大鼠鼻腔灌洗液TNF-β、IL-2、IL-6、IL-9表达比较 与正常对照组相比，模型组大鼠鼻腔灌洗液TNF-β、IL-2水平降低(P<0.05)，IL-6、IL-9水平升高(P<0.05)。与模型组相比，中药组大鼠鼻腔灌洗液TNF-β、IL-2水平升高(P<0.05)，IL-6、IL-9水平降低(P<0.05)；
pcDNA-IL-33组大鼠鼻腔灌洗液TNF-β、IL-2水平进一步降低(P<0.05)，IL-6、IL-9水平进一步升高(P<0.05)。中药+pcDNA-IL-33组上述指标变化与中药组相反(P<0.05，见表5)。
表5 大鼠鼻腔灌洗液TNF-β、IL-2、IL-6、IL-9表达水平比较
2.6 各组大鼠鼻黏膜组织IL-33、ST2阳性表达比较 与正常对照组相比，模型组大鼠鼻黏膜组织IL-33、ST2阳性表达水平升高(P<0.05)。与模型组相比，中药组大鼠鼻黏膜组织IL-33、ST2阳性表达水平降低(P<0.05)；
pcDNA-IL-33组大鼠鼻黏膜组织IL-33、ST2阳性表达平进一步升高(P<0.05)。中药+pcDNA-IL-33组上述指标变化与中药组相反(P<0.05，见图3，表6)。
A:正常对照组;B:模型组;C:中药组;D:pcDNA-IL-33组;E:中药+pcDNA-IL-33组;F:pcDNA-NC组;×200。
表6 大鼠鼻黏膜组织IL-33、ST2阳性表达比较
2.7 各组大鼠鼻黏膜组织IL-33、MyD88、TRAF6、T-bet、Gata3蛋白表达比较 与正常对照组相比，模型组大鼠鼻黏膜组织IL-33、MyD88、TRAF6、Gata3蛋白表达升高(P<0.05)，T-bet蛋白表达降低(P<0.05)。与模型组相比，中药组大鼠鼻黏膜组织IL-33、MyD88、TRAF6、Gata3蛋白表达降低(P<0.05)，T-bet蛋白表达升高(P<0.05)；
pcDNA-IL-33组大鼠鼻黏膜组织IL-33、MyD88、TRAF6、Gata3蛋白表达进一步升高(P<0.05)，T-bet蛋白表达进一步降低(P<0.05)。中药+pcDNA-IL-33组上述指标变化与中药组相反(P<0.05，见图4，表7)。
A：正常对照组；
B：模型组；
C：中药组；
D：pcDNA-IL-33组；
E：中药+pcDNA-IL-33组；
F:pcDNA-NC组。
表7 大鼠鼻黏膜组织IL-33、MyD88、TRAF6、Gata3、T-bet蛋白表达比较
AR主要以间歇性、持久性的鼻塞、喷嚏、清水样涕、鼻痒为临床症状，严重影响患者的工作和生活[9]。AR患者机体接触变应原或同种变应原再次进入机体后，机体产生的免疫球蛋白(IgE)可刺激肥大细胞脱颗粒活化，并释放大量组胺、半胱氨酰白三烯等多种炎症介质，加快细胞因子如IL-8、趋化因子如CCL2及生长因子如TGF-β等合成，刺激鼻黏膜毛细血管，增加鼻黏膜通透性及腺体分泌，介导AR鼻黏膜组织非感染性损伤的产生[10]。另外，AR患者机体产生IgE抗体时，也会刺激T淋巴细胞、嗜酸粒细胞、肥大细胞等免疫效应细胞，向鼻黏膜组织浸润，引起鼻黏膜组织损伤[11]。故IgE水平及嗜酸粒细数目，在AR诊断中有重要意义[12]。本研究构建AR模型后发现，大鼠血清IgE、IL-8、CCL2水平及外周血嗜酸粒细胞数目异常升高，AR症状评分(抓鼻、喷嚏、流涕等)明显升高，鼻黏膜组织水肿、上皮脱落、腺体增生、嗜酸性粒细胞及淋巴细胞浸润等病理损伤加重，提示造模成功。
近年来通过中药配方治疗疾病的案例逐渐增多，“芪丹益肺通窍颗粒”由玉屏风散加味而成，被证实在治疗肺气虚症性AR效果显著。许江涛等[13]及刘慧霞等[7]发现玉屏风散及加味后的“芪丹益肺通窍颗粒”可显著改善AR大鼠鼻黏膜组织炎症损伤，但具体的作用机理尚不清楚。本研究发现“芪丹益肺通窍颗粒”干预治疗后，大鼠血清IgE、IL-8、CCL2水平及外周血嗜酸粒细胞数目明显降低，AR症状评分降低，鼻黏膜组织病理损伤明显缓解，证实“芪丹益肺通窍颗粒”对AR有较好的治疗效果。但具体的作用机制有待进一步探究。
有文献指出，变应原或同种变应原入侵机体时，机体效应细胞-T淋巴细胞可迅速识别并呈递抗原，并介导机体细胞免疫及体液免疫的产生及转换，参与机体免疫应答过程[14]。T淋巴细胞可分化成Th1细胞及Th2细胞[15]。其中Th1细胞主要分泌IL-2、TNF-β等细胞因子，作用于B细胞抑制IgE生成，从而介导细胞免疫[16]。Th2细胞可分泌IL-6、IL-9等炎症因子刺激嗜酸性粒细胞趋化、上调黏附分子黏附与聚集、启动B淋巴细胞合成IgE等介导体液免疫反应[17]。当机体受到异常抗原刺激时，Th2细胞因子会过度表达，Th1细胞功能受到抑制，Th1/Th2比例失衡，细胞免疫反应减弱，导致AR等过敏性疾病的产生[18]。本研究发现，AR大鼠外周血Th1比例降低，Th2比例升高，Th1/Th2降低，鼻腔灌洗液中IL-2、TNF-β分泌减少，但IL-6、IL-9比例升高，提示AR大鼠出现Th1/Th2免疫功能失衡现象，与上述研究机理相一致。
ST2是IL-33的唯一受体，可表达于嗜酸粒细胞、肥大细胞、Th2细胞等免疫效应细胞中，在AR疾病中扮演重要角色[19]。研究证实，在AR疾病中，过敏原反复刺激机体导致鼻黏膜上皮细胞受损、坏死时，组织释放的IL-33可与各种免疫细胞表面的ST2受体结合，加速炎性细胞增殖活化，促进Th2型细胞转录因子(Gata3)表达，进一步抑制Th1型细胞转录因子(T-bet)表达，导致Th2型细胞功能过度激活，介导免疫失衡，IL-33/ST2通路在Th1/Th2免疫功能调节中发挥重要作用[4, 20]。本研究发现，AR大鼠黏膜组织上皮细胞胞浆中ST2、IL-33表达异常升高，MyD88、TRAF6表达升高，进一步上调IL-33表达后，大鼠Th1/Th2免疫功能失衡及AR症状加重，提示IL-33/ST2通路活化，可能是引起Th1/Th2免疫功能失衡，AR变应性炎症损伤发生的关键通路之一。本研究发现，“芪丹益肺通窍颗粒”组大鼠鼻黏膜组织中IL-33/ST2表达降低，Th1/Th2免疫功能逐渐恢复正常，提示“芪丹益肺通窍颗粒”抑制大鼠AR症状及鼻黏膜组织损伤可能与抑制IL-33/ST2通路激活有关。上调IL-33表达，可逆转“芪丹益肺通窍颗粒”的上述作用。
综上所述，“芪丹益肺通窍颗粒”可能通过抑制IL-33/ST2通路激活，抑制Th1/Th2免疫功能向Th2偏移，缓解大鼠AR症状。但机体免疫调节机制复杂，涉及多条通路共同调节，是否有其他通路间接参与调控“芪丹益肺通窍颗粒”改善大鼠AR变应性炎症症状，还需继续深入研究。
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