陈馨，刘霞霞，王文君，王萌，程卉*（1.安徽中医药大学药学院，合肥 230012；
2.安徽中医药大学科研技术中心，合肥 230038）
恶性黑色素瘤是由黑色素细胞恶性转化后形成的恶性肿瘤，其发病位置大多集中在皮肤表面，但有时也会在黏膜组织如眼脉络膜等其他身体部位发现[1]。黑色素瘤的发展是一个动态的过程，容易发生转移形成血管瘤，具有高侵袭性，是皮肤病变中病死率最高的一种疾病，目前其发病率在全球范围内呈上升趋势[2-5]。目前研究发现与铁死亡相关的细胞死亡途径对于黑色素瘤的调节具有关键作用，与未处理的细胞相比，铁死亡抑制剂预处理细胞后会导致黑色素瘤细胞发生更多转移[6]。这表明新的黑色素瘤的治疗方法的开发可以从参与铁死亡调节的靶点入手。
铁死亡是最近发现的一种调控细胞死亡形式。其形态学特征是存在比正常线粒体更小的线粒体，线粒体膜密度浓缩，线粒体嵴减少或消失，外线粒体膜破裂。而影响铁死亡的因素有亚铁、活性氧（ROS）和谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）[7]。在形态学、生化和遗传水平上，铁死亡与其他调控细胞死亡的形式不同。研究表明，人类和动物的多种生理条件和病理应激均可引发铁死亡[8]。
重楼为合科植物云南重楼ParispolyphyllaSmithvar.Yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz .或七叶一枝花Paris polyphylla Smithvar.chinensis（Franch.）Hara 的干燥根茎[9]，是一种常用中药，至今有两千多年的用药历史，性苦，微寒，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效。其化学成分主要有甾体皂苷类、胡萝卜苷、氨基酸类的有效成分等，其中重楼皂苷Ⅱ是重楼主要有效成分之一。据报道，重楼皂苷Ⅱ在肺癌、膀胱癌、卵巢癌、黑色素瘤等癌症中均表现出较好的抗肿瘤特性[10-14]。本实验旨在研究重楼皂苷Ⅱ抑制黑色素瘤的增殖，并探讨其抑制黑色素瘤B16F10细胞增殖是否通过诱导肿瘤细胞铁死亡来介导。
1.1 细胞株
黑色素瘤细胞 B16F10（中国科学院细胞库）。
1.2 试药
重楼皂苷Ⅱ（纯度91.4%，中国食品药品检定研究院）。胎牛血清（上海逍鹏生物科技有限公司）；
Roswell Park Memorial Institute-1640（RPMI-1640）培养基（武汉塞维尔生物科技有限公司）；
青霉素-链霉素溶液、ROS试剂盒、BCA蛋白浓度试剂盒、一抗稀释液（碧云天生物技术有限公司）；
丙二醛（MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、谷胱甘肽（GSH）试剂盒、Fe 试剂盒（南京建成生物工程研究所）；
β-肌动蛋白（β-actin，成都正能生物技术有限责任公司）；
谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4，美国 Cell Signaling Technology公司）；
溶质载体家族7成员11（SLC7A11）重组蛋白、重组人铁蛋白重链1（FTH-1）（江苏亲科生物研究中心有限公司）；
酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）重组蛋白（美国 abcam 公司）；
肿瘤蛋白53（P53）、山羊抗兔的 IgG-HRP 标记（成都正能生物技术有限责任公司）；
ECL化学发光底物试剂盒（北京biosharp公司）。
1.3 仪器
CO2培养箱（美墨尔特贸易有限公司）；
全波段多功能酶标仪iD3（美国 MD 公司）；
流式细胞仪FC500（美国 BECKMAN 公司）；
凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；
透射电子显微镜HITACHI-600（日本日立公司）。
2.1 细胞培养
细胞在含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基中培养，并且置于37℃，5%CO2的培养箱中培养。每日更换培养基，取对数生长细胞，用于后续实验。
2.2 MTT法检测细胞活力
将黑色素瘤细胞B16F10以每孔5×103个细胞的密度接种于96孔板，待细胞汇合度达到70%～80%后分别用0、1、2、4、8、16、32 μmol·L-1的重楼皂苷Ⅱ处理后培养24 h和48 h，采用MTT法检测细胞存活率，在每孔中加入MTT（终质量浓度为0.5 mg·mL-1）后将细胞放置于37℃恒温培养箱中孵育4 h。吸弃旧培养基后加入二甲基亚砜溶解细胞中的甲瓒，并在摇床上震摇10 min。最后，在570 nm处检测OD值。
2.3 透射电镜（TEM）观察线粒体结构
取对数生长期的B16F10细胞，将细胞以2×106个·mL-1的密度接种于100 mm培养皿中培养，待细胞汇合度达到70%～80%后，分别用0、2 μmol·L-1的重楼皂苷Ⅱ处理后培养24 h后，收集细胞，离心去上清液（4500 r·min-1，10 min）；
用电镜固定液（2.5%戊二醛）于4℃固定 24 h，四氧化锇固定细胞25 min 以上，然后不同浓度的乙醇溶液将细胞团块梯度脱水并包埋于环氧树脂中，使用电镜专用切片机制成电镜切片；
醋酸双氧铀染色后再用醋酸铅染色，于透射电子显微镜下观察细胞并摄片。
2.4 流式细胞仪检测ROS含量
取对数生长期的B16F10细胞，将细胞以2×105个·mL-1的密度接种于6孔板，待细胞汇合度达到70%～80%后，分别用0、1、2、4 μmol·L-1的重楼皂苷Ⅱ处理后培养24 h。弃去旧培养基，加入用无血清培养液稀释的 DCFHDA 探针，于37℃细胞培养箱中孵育 20 min后消化收集细胞于流式细胞仪上机检测。实验数据通过FlowJo_V10 软件进行分析。
2.5 MDA含量的检测
取对数生长期的B16F10细胞，将细胞以2×105个·mL-1的密度接种于6孔板，待细胞汇合度达到70%～80%后，分别用0、1、2、4 μmol·L-1的重楼皂苷Ⅱ处理后培养24 h。在冰上消化收集细胞，超声破碎细胞后，根据MDA试剂盒说明书进行操作。每组设3个复孔，使用酶标仪在 532 nm 处测量吸光度A。
2.6 SOD含量的检测
取对数生长期的B16F10细胞，将细胞以2×105个·mL-1的密度接种于6孔板，待细胞汇合度达到70%～80%后，分别用0、1、2、4 μmol·L-1的重楼皂苷Ⅱ处理后培养24 h。在冰上消化收集细胞，超声破碎细胞后，根据 SOD试剂盒说明书进行操作。每组设3个复孔，使用酶标仪在 450 nm 处测量吸光度A。
2.7 GSH含量的检测
取对数生长期的B16F10细胞，将细胞以2×105个·mL-1的密度接种于6孔板，待细胞汇合度达到70%～80%后，分别用0、1、2、4 μmol·L-1的重楼皂苷Ⅱ处理后培养24 h。在冰上消化收集细胞，超声破碎细胞后离心取上清液（3500 r·min-1，10 min），根据 GSH 试剂盒说明书进行操作。每组设3个复孔，使用酶标仪在405 nm 处测量OD值。
2.8 Fe含量的检测
取对数生长期的B16F10细胞，将细胞以2×105个·mL-1的密度接种于6孔板，待细胞汇合度达到70%～80%后，分别用0、1、2、4 mol·L-1的重楼皂苷Ⅱ处理后培养24 h。在冰上消化收集细胞，超声破碎细胞后离心取上清液（2500 r·min-1，10 min），根据 Fe 试剂盒说明书进行操作。每组设3个复孔，使用酶标仪在520 nm 处测量吸光度A。
2.9 Western blot检测相关蛋白表达
取对数生长期的B16F10细胞，将细胞以2×106个·mL-1的密度接种于100 mm培养皿中培养，待细胞汇合度达到70%～80%后，用0、1、2、4 μmol·L-1的重楼皂苷Ⅱ处理后培养24 h。在冰上消化收集细胞，用含有磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液超声提取蛋白。采用BCA蛋白测定法测定蛋白含量。加入10% SDS-PAGE处理蛋白质，加热变性后，得到蛋白质样品。根据蛋白质的分子量的不同使用特定的电压来分离蛋白质，分离的蛋白质转移到硝化纤维素滤膜上，在5%的脱脂牛奶中封膜，然后一抗4℃孵育过夜。主要抗体及稀释比：β-actin（1∶1000）；
GPX4（1∶1000）；
SLC7A11（1∶1000）；
FTH-1（1∶1000）；
P53（1∶1000）；
ACSL4（1∶1000）。最后，用含有1%Tween-20的Tris缓冲盐溶液冲洗3遍膜，在二抗（1∶10 000）中室温孵育2 h。使用ECL试剂盒显色在凝胶分析系统进行检测，使用Image J软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。
2.10 统计学分析
所有数据均采用GraphPad Prism 7软件进行处理，数据以平均值±标准差表示，多组均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用配对t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
3.1 重楼皂苷Ⅱ对黑色素瘤B16F10细胞的抑制作用
MTT结果表明，与空白组比较，B16F10细胞存活率随着重楼皂苷Ⅱ作用剂量的增大和时间的延长而降低（P＜0.01，见图1）。重楼皂苷Ⅱ作用于黑色素瘤细胞B16F10 24 h和48 h后的IC50值分别为（1.568±0.219）、（1.293±0.199）μmol·L-1，综合考虑以1、2、4 μmol·L-1为后续实验重楼皂苷Ⅱ的低、中、高剂量。
图1 重楼皂苷Ⅱ对B16F10细胞活力的影响Fig 1 Effect of polyphyllinⅡ on the viability of B16F10 cells
3.2 重楼皂苷Ⅱ对黑色素瘤B16F10细胞中线粒体结构的影响
透射电镜观察B16F10 细胞线粒体的形态和微观结构发现，空白组细胞的细胞核形态完整，细胞核膜明显，线粒体结构清晰；
重楼皂苷Ⅱ（2 μmol·L-1）作用细胞后，细胞核形态不完整，细胞核的核膜破裂，线粒体明显皱缩变小，线粒体的膜密度明显增加（见图2），这些都是细胞发生铁死亡的重要特征。
图2 透射电镜下B16F10细胞线粒体的结构（×4000）Fig 2 Structure of mitochondria in B16F10 cells observed under transmission electron microscope（×4000）
3.3 重楼皂苷Ⅱ对黑色素瘤B16F10细胞ROS的影响
结果显示，ROS随着重楼皂苷Ⅱ给药浓度的增加在B16F10细胞中不断积累，与空白组相比，ROS的含量显著上升，且具有剂量依赖性（见图3）。
图3 重楼皂苷Ⅱ对B16F10细胞ROS含量的影响Fig 3 Effect of polyphyllinⅡ on the ROS content of B16F10 cells
3.4 重楼皂苷Ⅱ对黑色素瘤B16F10细胞MDA、SOD、GSH和Fe含量的影响
结果显示MDA和Fe的含量随着重楼皂苷Ⅱ给药浓度的增大而升高，与空白组比较，中、高剂量组差异均具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；
SOD和GSH的含量随着重楼皂苷Ⅱ给药浓度的增大而显著降低，与空白组比较，中、高剂量组差异均具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）（见图4）。
图4 重楼皂苷Ⅱ对B16F10细胞中MDA、SOD、GSH和Fe含量的影响Fig 4 Effect of polyphyllinⅡ on the content of MDA，SOD，GSH and Fe in B16F10 cells
3.5 重楼皂苷Ⅱ对黑色素瘤B16F10细胞铁死亡相关蛋白的影响
与空白组比较，铁死亡标志性蛋白GPX4、FTH-1、SLC7A11在重楼皂苷Ⅱ作用于B16F10细胞后的表达水平呈下降趋势（P＜0.05，P＜0.01），且呈现剂量依赖性；
而P53和ACSL4在中、高剂量重楼皂苷Ⅱ作用于B16F10细胞后的表达水平呈上升趋势（P＜0.01）（见图5）。
图5 重楼皂苷Ⅱ对B16F10细胞中铁死亡相关蛋白表达的影响Fig 5 Effect of polyphyllinⅡ on the expression of ferroptosis-related proteins in B16F10 cells
黑色素瘤是一种来源于皮肤表皮层中黑色素细胞的皮肤恶性肿瘤[15]，作为一种侵袭性皮肤癌，皮肤恶性黑素瘤导致的相关死亡在所有皮肤癌中占75%[3]，目前治疗黑色素瘤主要以手术切除为主，辅助放化疗和免疫治疗，但治疗效果有限，亟待开发新的有效治疗手段[16]。铁死亡是Dixon在2012年首次提出的一种新的细胞死亡方式[17]。研究表明，铁死亡可能是由人类和动物的多种生理条件和病理应激引起的[18]。目前铁死亡已经逐渐成为消除恶性细胞的关键特征之一，它通过去除环境中缺乏关键营养素或因感染或环境应激而受损的细胞，在抑制肿瘤发生中发挥着关键作用[19]。重楼皂苷Ⅱ是中药重楼的有效成分之一，具有抑制多种肿瘤的作用[20-22]。本实验通过重楼皂苷Ⅱ作用于黑色素瘤细胞B16F10，从体外研究发现重楼皂苷Ⅱ可以通过诱导B16F10细胞发生铁死亡从而抑制细胞增殖生长。
铁死亡是一种由GPX4活性丧失和随后产生的ROS积累引起细胞死亡的调节形式，主要依赖铁和ROS的调控[23]。SOD和GSH是维持细胞内氧化还原稳态的重要核心组成部分，任何使GSH和SOD减少的因素都会引起细胞内 ROS 水平的升高。MDA可能由于脂质氧化而受到大量自由基的影响而增加，是一种脂质过氧化的标志物，可以直接反映细胞氧化应激水平[24]。此外，铁作为一种催化剂，将过氧化物转化为自由基，发生芬顿反应，这可能是铁死亡诱导细胞死亡发生所起到的作用[23]。重楼皂苷Ⅱ可以在B16F10细胞内增加MDA 含量，降低SOD和GSH的含量从而引起的大量ROS积累。表明重楼皂苷Ⅱ可以引起B16F10细胞中ROS和铁的积累从而诱导细胞发生铁死亡。
抑癌蛋白P53可以引起肿瘤细胞的细胞周期阻滞、衰老、凋亡等，在肿瘤的发生发展过程中具有重要的作用。P53还可调节大量不同的细胞功能，如代谢调节、ROS应激反应和铁死亡，这些新出现的功能在P53介导的肿瘤抑制中发挥关键作用[25]。P53由于其可以诱导肿瘤细胞发生铁死亡，所以仍然发挥抑制肿瘤增殖的能力[19]。研究表明SLC7A11基因是P53介导的转录抑制的一个靶点[26]，SLC7A11是胱氨酸/谷氨酸逆向转运体的一个组成部分，通过介导胱氨酸转运促进GSH的合成，而GSH是主要的细胞抗氧化剂，可以抑制ROS的累积，对ROS诱导的铁死亡至关重要[7]。P53的激活可以抑制SLC7A11的转录，进而减少了胱氨酸的摄取，这反过来又限制了细胞内 GSH的产生。因此，ROS诱导的铁死亡在P53激活的细胞中明显增加[27]。实验结果表明重楼皂苷Ⅱ可以通过促进P53 的表达、抑制SLC7A11 的表达，从而促进细胞铁死亡的发生。
GPX4可以作为判断细胞铁死亡的指标之一，GPX4将GSH转化为氧化型谷胱甘肽（GSSG），同时将脂质氢过氧化物转化为相应的醇或游离过氧化氢转化为水[7]。FTH-1是铁蛋白重链1，在铁蛋白结构中起到关键作用，也是铁死亡发生的标志性蛋白。ACSL4可以通过参与易被氧化的膜磷脂合成过程而成为铁死亡发生的必需分子[28]。GPX4、FTH-1蛋白的表达随着重楼皂苷Ⅱ的浓度的增加而下降，而ACSL4蛋白的表达呈现上升趋势。这些重要蛋白分子表达水平的变化显示重楼皂苷Ⅱ对B16F10细胞的抑制作用可能与铁死亡相关。
综上所述，本研究初步证明了铁死亡是重楼皂苷Ⅱ诱导黑色素细胞B16F10细胞发生死亡的重要途径，但是发生铁死亡的具体机制还有待进一步实验研究验证。
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