刘琳琳，李玉薇，邹勇，张雪梅，卢佳，刘小可，王泽鋆，刘玉林，刘景会
1.长春生物制品研究所有限责任公司，吉林 长春 130012；
2.武汉生物制品研究所有限责任公司，湖北 武汉 430000
干扰素（interferon，IFN）作为广谱抗病毒药物，是目前用于临床治疗最重要的细胞因子之一。IFN在宿主细胞受到刺激（如病毒、细菌等各种病原体感染）时产生，并最终启动机体免疫系统的防御机制［1］。IFN 作用于同一或邻近细胞的IFN 受体，激活一系列抗病毒级联反应，从而诱导上百种含IFN 刺激反应元件的基因转录［2］。这些IFN 激活大量抗病毒相关基因的表达，如2′，5′-寡腺苷酸合成酶、蛋白激酶、抗黏液病毒蛋白等［3］。严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）Omicron 株在感染早期可能传染性较高，但当其试图扩散至上呼吸道以外或遇IFN 抑制时，病毒数量及感染能力会迅速下降。IFN作为天然免疫的关键细胞因子，是防御病毒入侵的第一道防线。研究表明，使用IFN 后，虽然其自身在人体内代谢较快，但其激发的抗病毒蛋白可在人体内稳定存在多日［4］。感染前或感染早期，IFN 会有效刺激上皮细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制或清除Omicron株病毒，但如果细胞已被病毒破坏，IFN 则无法修复被感染细胞。因此，感染初期，IFNα 对SARS-CoV-2 的抑制是有效的。
免疫力低下人群不能及时产生足量内源性IFNα，使病毒获得复制机会，这是部分人群易感并逐步趋向重症化的原因。因此，提前补充外源IFNα 可快速提高人体免疫力，达到预防病毒及抗病毒的目的。IFN 具有广谱抗病毒效果，对呼吸道合胞病毒、疱疹病毒、流感病毒、副流感病毒、冠状病毒等呼吸道病毒均具有抑制作用［5］。国家卫生健康委员会连续印发的第一至第八版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》，均推荐成人每日2 次雾化吸入500 万IU 或相当剂量IFNα［6］。眼部、鼻腔、咽部、呼吸道黏膜系统缺少角质层保护，且有病毒受体，是病毒感染初期主要途径。而呼吸道黏膜系统有IFNα受体，通过使用人IFNα1b滴眼（眼部黏膜、鼻泪管）、滴鼻、喷鼻（鼻腔和咽部）也可使上呼吸道黏膜系统在IFN 作用下产生大量抗病毒蛋白，使机体处于抗病毒状态，有效阻止病毒吸附、脱壳、核酸复制、组装、释放等，从而抑制病毒感染、增殖，起到应急预防和早期治疗的作用。
本研究在体外细胞水平上，采用qPCR 法检测人IFNα1b 对 SARS-CoV-2 Omicron 株（BA.5／BA.2／BA.1）的抑制效果，探索低活性／浓度人IFNα1b 的抗病毒作用，对评价人IFNα1b 在应急预防和治疗SARS-CoV-2感染上的有效性具有重要意义。
1.1 病毒及细胞 SARS-CoV-2 Omicron 株（BA.5／BA.2／BA.1）由武汉生物制品研究所有限责任公司提供，常规传代，-80 ℃保存，Vero 细胞也由该公司提供。
1.2 IFN及阳性对照药 人IFNα1b原液（批号：SCF1-B202201，蛋白含量：3.8 mg／mL，生物学活性：5.1 ×107IU／mL）、人IFNα1b滴眼液（批号：20220502，生物学活性：1.0×105IU／mL，比活性1.5×107IU／mg，分子量：19 382 kD）、人IFNα1b 喷雾剂（批号：2022-1106，生物学活性：5.0 × 105IU／mL）均由长春生物制品研究所有限责任公司提供；
瑞德西韦（Remde-sivir）购自美国吉利德科技公司。
1.3 主要试剂及仪器 DMEM 培养基、胰蛋白酶、无菌PBS 缓冲液（pH 7.2 ～7.4）购自迈晨科技（北京）有限公司；
CCK-8 试剂购自上海碧云天生物技术有限公司；
DMSO 购自生工生物工程（上海）股份有限公司；
核酸提取或纯化试剂（批号：2021108）、新型冠状病毒2019-nCoV 核酸检测试剂盒（批号：2021208）、全自动核酸提取仪（Stream SP96）购自广州达安基因股份有限公司；
细胞培养瓶、96 孔培养板购自美国Corning公司；
实时荧光定量PCR仪（QuantStudio5）购自美国ABI公司。
1.4 细胞毒性检测 采用CCK-8法检测人IFNα1b原液、人IFNα1b滴眼液、人IFNα1b喷雾剂、瑞德西韦共4种药物的细胞毒性。将Vero细胞按2×104个／mL接种 96 孔板，0.1 mL／孔，37 ℃，5% CO2孵箱培养18 ～24 h 至细胞长成单层；
弃培养基，加入不同浓度工作液［人IFNα1b 原液：稀释至1 × 107IU／mL 后，进行 3 倍系列稀释，共 8 个稀释度；
人 IFNα1b 滴眼液：稀释至1 × 105IU／mL 后，进行3 倍系列稀释，共8 个稀释度；
人IFNα1b喷雾剂：稀释至1×105IU／mL后，进行3 倍系列稀释，共8 个稀释度；
阳性对照药：瑞德西韦稀释至 150 μmol／L 后，进行 3 倍系列稀释，共8 个稀释度］，100 μL／孔，每个稀释度重复6孔，37 ℃，5% CO2孵箱培养 72 h；
加入 CCK-8 试剂，20 μL／孔，继续培养1 ～ 4 h；
检测各孔450 nm 波长处的A值，按下式计算受试物对细胞存活率的影响，将数据输入GraphPad Prism 计算半数毒性浓度（CC50）。
细胞存活率（%）=［（A实验孔-A空白孔）／（A对照孔-A空白孔）］×100%
1.5 抗SARS-CoV-2 Omicron株活性检测
采用qPCR法［7-15］。将Vero细胞按2 × 104个／mL接种96 孔板，37 ℃，5% CO2孵箱培养至细胞长成单层，备用。
1.5.1 人IFNα1b预孵育2 h后攻毒 将人IFNα1b原液稀释至5×103IU／mL，进行3 倍系列稀释，共8 个稀释度，每个稀释度设4个复孔，作为IFN 抑制组；
将50 μmol／L瑞德西韦进行3倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度设2 个复孔，作为瑞德西韦抑制组。将各组药品接种96孔板，100 μL／孔，37 ℃，5%CO2孵箱继续培养2 h；
弃培养基，PBS洗板2次，100 μL／孔，同时设细胞对照组（正常细胞培养）和病毒对照组（仅在细胞中加入病毒）；
将Omicron株（BA.5／BA.2／BA.1）按MOI=0.01 加入相应细胞孔，100 μL／孔，37 ℃，5%CO2孵箱培养2 h；
弃病毒液，PBS洗板2次，100 μL／孔，加入细胞维持液，200 μL／孔，37 ℃，5%CO2孵箱继续培养24 ～72 h。显微镜下观察细胞病变形态，病毒对照组细胞病变程度超过75%以上时进行qPCR检测。
1.5.2 人IFNα1b 与病毒同孵育 IFNα1b 原液和瑞德西韦稀释以及Omicron 株（BA.5／BA.2／BA.1）攻毒剂量同1.5.1 项。将药品与病毒同时加入Vero细胞，37 ℃，5% CO2孵箱培养2 h；
弃混合液，PBS 洗板2 次，100 μL／孔，加入细胞维持液，200 μL／孔，37 ℃，5%CO2孵箱继续培养。显微镜下观察细胞病变形态，在病毒对照组病变程度超过75%以上时进行qPCR检测。
1.6 qPCR 法 培养结束后，每孔取上清液0.2 mL，依次加入0.5 mL 裂解液和0.02 mL 蛋白酶K，混匀，70 ℃加热15 min，收集样品，全自动核酸提取仪提取核酸，采用新型冠状病毒2019-nCoV 核酸检测试剂盒，于实时荧光定量PCR仪上检测SARS-CoV-2 RNA水平。按下式计算不同稀释倍数下供试品对SARSCoV-2 的抑制率，将数据输入GraphPad Prism 计算半数有效浓度（EC50）。
抑制率（%）=［1-（药品组病毒核酸拷贝数／病毒对照组病毒核酸拷贝数）］×100%
2.1 细胞毒性 结果显示，人IFNα1b原液CC50无法计算，所有试验孔状态良好，表明最高浓度（1×107IU／mL）人IFNα1b 原液对Vero 细胞未达到半数细胞毒性；
瑞德西韦CC50无法计算，所有试验孔状态良好，表明最高浓度（150 μmol／L）瑞德西韦对 Vero 细胞未达到半数细胞毒性；
人IFNα1b滴眼液的CC50为29 958 IU／mL，人 IFNα1b 喷雾剂的 CC50为 37 550 IU／mL，表明高浓度人IFNα1b 滴眼液和人IFNα1b 喷雾剂对Vero 细胞具有毒性。见图1。
图1 人IFNα1b原液（A）、人IFNα1b滴眼液（B）、人IFNα1b喷雾剂（C）、瑞德西韦（D）对Vero细胞毒性的检测Fig.1 Determination of cytotoxicity of human IFNα1b bulk（A），human IFNα1b eye drops（B），human IFNα1b spray（C）and Redesivir（D）on Vero cells
2.2 人IFNα1b抗SARS-CoV-2 Omicron株活性
2.2.1 人 IFNα1b 预孵育 2 h 后攻毒 人 IFNα1b 对BA.1 株的 EC50为 9.30 IU／mL（32 pmol／L），瑞德西韦为 0.314 7 μmol／L；
人 IFNα1b 对 BA.2 株的EC50为 13.38 IU／mL（46 pmol／L），瑞德西韦为0.291 0 μmol／L；
人 IFNα1b 对 BA.5 株的 EC50为12.33IU／mL（42.4pmol／L），瑞德西韦为0.3003μmol／L。见图2。
图2 预防组人IFNα1b（A）和瑞德西韦（B）对SARS-CoV-2 Omicron株（BA.5／BA.2／BA.1）的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of human IFNα1b（A）and Remdesivir（B）against SARS-CoV-2 Omicron strain（BA.5／BA.2／BA.1）in prevention group
2.2.2 人IFNα1b 与病毒同孵育 人IFNα1b 对BA.1株的EC50为19.68 IU／mL（67.7 pmol／L），瑞德西韦为 0.320 5 μmol／L；
人 IFNα1b 对 BA.2 株的 EC50为10.91IU／mL（37.5pmol／L），瑞德西韦为0.2744μmol／L；
人IFNα1b对BA.5株的EC50为18.84 IU／mL（64.8pmol／L），瑞德西韦为0.304 1 μmol／L。见图3。
图3 同时攻毒组人IFNα1b（A）和瑞德西韦（B）对SARSCoV-2 Omicron株（BA.5／BA.2／BA.1）的抑制效果Fig.3 Inhibitory effect of human IFNα1b（A）and Remdesivir（B）against SARS-CoV-2 Omicron strain（BA.5／BA.2／BA.1）in simultaneous challenge group
目前由SARS-CoV-2 感染引起的新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）疫情仍在全球暴发流行［16-19］。2022年底，我国出现各种SARSCoV-2 Omicron 株大规模感染，具有传播速度快、毒力强和容易免疫逃逸等特点［20-22］。SARS-CoV-2病原学复杂，易发生变异，给疫苗研究和有效接种带来了巨大困难，目前仍缺乏针对性特效药物［23-25］。
本研究结果显示，在体外细胞水平上，极低活性／浓度的人IFNα1b对SARS-CoV-2 Omicron株（BA.5／BA.2／BA.1）均具有较好的抑制活性，且人IFNα1b原液的细胞毒性极低，治疗指数高，优于阳性对照药物。关于人IFNα1b在体内是否具有相同的抑制效果，尚需进一步确认，因此后续将开展人IFNα1b 体内抗SARS-CoV-2 Omicron 株感染的药效评价。
研究表明，SARS-CoV-2 在鼻腔的内皮细胞滴度相对较高，咽喉和支气管逐渐降低，肺部相对较低，这种病毒的感染模式和分布提示，IFN通过滴鼻或喷雾递送至鼻腔或喉咙，可能在局部有效抑制SARSCoV-2 的感染［26］，起到类似疫苗的预防作用。因此，人IFNα1b 滴眼液和人IFNα1b 喷雾剂有希望成为临床预防SARS-CoV-2 Omicron株感染的特效药。
猜你喜欢西韦喷雾剂瑞德瑞德西韦在体外抑制猪流行性腹泻病毒复制的研究中国预防兽医学报(2022年8期)2022-11-05光影汉语世界(The World of Chinese)(2022年3期)2022-06-15瑞德西韦聚合物纳米胶束的制备及表征药学研究(2022年3期)2022-04-07Close to Heaven汉语世界(The World of Chinese)(2021年1期)2021-02-22Market Values汉语世界(The World of Chinese)(2020年5期)2020-11-02Acts of Faith PHOTOGRAPHY BY汉语世界(The World of Chinese)(2020年4期)2020-08-14美国FDA紧急批准瑞德西韦(Remdesivir)用于治疗COVID-19广东药科大学学报(2020年3期)2020-03-03吉利德公司研发的抗病毒药瑞德西韦获美国FDA治疗COVID-19的紧急使用授权中国感染与化疗杂志(2020年6期)2020-01-12喷雾剂作文中学版(2019年11期)2019-11-27喷雾剂作文中学版(2018年12期)2018-11-28