曹寅生，易 强，邝高艳，危建文，金久楚，罗振华*
1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；
2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208
膝骨关节炎(knee osteoarthritis, KOA)是一种以关节软骨逐渐破坏为重要特征的退行性关节疾病[1]，在成年人群中其发病率随年龄的增长而上升，是老年人重要的致残因素之一，目前其发病机制尚未充分研究[2]。
一直以来，无完全治愈骨关节炎疾病的特效药物，可用的治疗方法主要集中在缓解症状和延缓疾病进展上[3]，不同药物治疗KOA 的作用机制也有待研究。中医药治疗因其独特的作用机制，在防治骨关节疾病中有着特殊的优势。
追风透骨胶囊是由经典名方小活络丹、苓桂术甘汤、九味羌活汤化裁而来，具有祛风除湿、通经活络、散寒止痛之功效，对治疗KOA 具有明显疗效。
临床研究表明，单独使用与追风透骨胶囊相同药物组成的追风透骨丸治疗KOA，可显著缓解膝关节疼痛并改善其功能[4]，其改进剂型追风透骨胶囊在临床上联合玻璃酸钠治疗KOA，同样可有效缓解患者早中期KOA 疼痛症状并改善膝关节功能[5]。
骨关节炎患者软骨组织中Toll 样受体4（Tolllike receptor 4, TLR4）/髓细胞分化初级反应蛋白88（myeloid differentiation primary response protein 88,MyD88）/核 因 子kappa-B（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信号通路呈持续活化状态，骨关节炎的发生、进展可能与之相关[6]。
追风透骨胶囊治疗KOA的作用机制可能与TLR4/MyD88/NF-kB 信号通路相关，与白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)促炎细胞因子的分泌相关。
本研究拟通过动物实验，阐明追风透骨胶囊治疗KOA 动物模型、缓解KOA 进展的作用机制，为中医药防治KOA 提供有效的动物实验理论依据。
1.1 动物
健康雄性6 月龄新西兰大白兔50 只，清洁级，体质量（2500±500） g，动物购买及饲养均于湖南中医药大学动物实验中心完成[动物许可证号：SCXK(湘)2020-0005；
单位许可证号：SYXK（湘）2019-0009]。
本实验经湖南中医药大学伦理委员会批准（伦理审查号：LLBH-202007070001）。
1.2 主要药物与试剂
追风透骨胶囊（天地横一制药股份有限公司，规格：0.26 g/粒，批号：200505）；
硫酸氨基葡萄糖胶囊（浙江海正药业股份有限公司，规格：0.314 g/粒，批号：71812133）；
miRNA 逆转录试剂盒（康为世纪有限公司，批号：CW2141）；
SuperECLPlus 超敏发光液（美国Advansta 公司，批号：K-12045-D50）；
兔NF-κB抗体、TLR4 抗体、MyD88 抗体（美国Proteintech 公司，批号分别为10745-1-AP、19811-1-AP、23230-1-AP）；
二步法试剂盒、DAB 试剂盒（中杉金桥有限公司，批号分别为600D54、600W23）；
兔IL-6 抗体、IL-1β 抗体、TNF-α 抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号分别为bs-6312R、bs-0812R、bs-7320R）。
1.3 主要仪器
台式冷冻离心机（湖南湘仪有限公司，型号：H1650R）；
荧光定量RCP 仪、荧光PCR 板（美国Thermo 公司，型号分别为PIKOREAL96、SPL0960）；
电泳仪、水平琼脂糖电泳槽（北京六一有限公司，型号分别为DYY-2C、DYCP-31DN）；
摇床（型号：TS-1）旋涡混合器（型号：GL-88B）均购自江苏其林贝尔有限公司；
磁力搅拌器（中国雷磁有限公司，型号：JB-13）；
-80 ℃冰箱（中国美菱有限公司，型号：DW-HW438）。
2.1 造模
参考改良Videman 造模法[7-8]造模。
（1）用卷尺测量兔左侧踝关节上约1 cm 小腿的周长记录为下周长，测量腹股沟下约0.5 cm 左侧大腿根部的周长，记录为上周长，用直尺测量兔左下肢完全伸直状态下大腿内侧中线上踝关节上约1 cm 至大腿根部下约0.5 cm 的直线长度，记录为纵轴长。
剪取长度保证足够包绕兔左下肢1 周的高分子绷带，离体制作成管型，管型高分子绷带的一端内表面周长为下周长加3～4 cm，另一端内表面周长为上周长加0.5 cm，管型的长度为纵轴长。
先用剪刀修剪管型高分子绷带两端尖锐部分并使之整齐圆润，然后以数层透明胶带包绕其上下两端及外表面。
在离管型高分子绷带上端约0.5 mm 处，用老虎钳把1 mm 的铁丝穿过管型，打结后拧成一个直径约为8 mm 的金属环，检测其牢固程度，将宽10 cm、长30 cm 的弹性绷带穿过金属环。
在助手的帮助下使兔左下肢处于完全伸直状态，然后缓慢地将其左下肢自上而下插入管型高分子绷带中，把弹性绷带打结，使之环绕大腿根部前方的躯干1 周，调整悬吊式外固定支具，使之固定兔左膝关节于伸直位而不脱落。
（2）将兔放回笼中观察1 h，如兔左下肢因造模支具过度压迫导致血运障碍，则立即剪断弹性绷带，取下管型高分子绷带，待后左下肢血运正常后重新调整造模；
若血运良好，则先在管型高分子绷带外表面及上下缘缠绕包裹细铁丝网，再用数层透明胶带覆盖，防止管型高分子绷带被啃咬破坏。每天观察造模支具佩戴情况，连续观察6 周。造模期内，如发现造模支具脱落或模型兔造模侧下肢出现损伤，予以重新固定。
模型验证：造模6 周后，从正常组和KOA 造模组中按随机数字表法各选取3 只兔行KOA 模型验证，验证方法包括观察对比两组兔造模侧膝关节的功能活动，以及膝关节软骨大体观察及HE 染色观察对比。
若造模组较正常组膝关节活动功能障碍，关节软骨破坏明显，Pelletier 评分及Mankin 评分明显升高，则造模成功。
验证成功后，完成药物干预阶段的随机分组，第2 天以灌胃的方式开始给药。
2.2 分组及给药
适应性喂养2 周后，从50 只新西兰兔随机选取10 只作为正常组，其余40 只为KOA 造模组。
造模观察6 周后，从KOA 造模组和正常组中各随机选取3 只兔行KOA 模型验证，KOA 模型验证成功后重新随机分组，从剩余的正常组中随机选取6 只作为空白组(A 组)，将剩余的KOA 造模组抽取30 只随机分为模型组(B 组)、硫酸氨基葡萄糖组(C 组)、追风透骨胶囊低剂量组(D 组)、追风透骨胶囊中剂量组(E 组)、追风透骨胶囊高剂量组(F 组)，每组6 只。
重新分组后开始给药，E 组：根据追风透胶囊成人每次用量为1.04 g，2 次/d，则60 kg 成人每千克每次用药量为17 mg，参照剂量-体表面积换算方法[9]计算兔给药量。
得出兔每次的给药量为56 mg/kg，药物和蒸馏水混合后充分搅拌均匀，配制成混悬液，灌胃量为10 mL/kg，2 次/d。
D 组：给药量为28 mg/kg，灌胃量为10 mL/kg，2 次/d。
F 组：给药量为112 mg/kg，灌胃量为10 mL/kg，2 次/d。
C 组：硫酸氨基葡萄糖给药量为50 mg/kg，灌胃量为10 mL/kg，2次/d。A、B 组：予蒸馏水灌胃，灌胃量为10 mL/kg，2 次/d。
2.3 观察指标及检测
外科无菌操作暴露兔造模侧膝关节软骨面，在完成对关节软骨的大体观察及Pelletier 评分[10]后，在冰盒上取下股骨远端及胫骨平台的膝关节软骨组织，部分置于冻存管中-80 ℃冻存，用于提取研究相关的蛋白及mRNA，检测软骨中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量，部分用于HE 染色观察及Mankin 评分[11]。
2.3.1 造模侧膝关节软骨大体观察及Pelletier 评分
药物干预6 周后，空气栓塞处死实验兔，解剖每只兔造模侧膝关节，对关节软骨行大体观察并拍取照片，采用Pelletier 评分[10]评估软骨损伤情况。0 分：关节面光整，色泽如常；
1 分：关节面粗糙，有小的裂隙且色泽灰暗；
2 分：关节面糜烂，软骨缺损深达软骨表中层；
3 分：关节面溃疡形成，缺损深达软骨深层；
4 分：软骨剥脱，软骨下骨暴露。软骨损伤程度与分数呈正相关。
2.3.2 膝关节软骨HE 染色观察及Mankin 评分 对大体观察及Pelletier 评分完成后的软骨标本进行处理，切取适量关节软骨，予固定、脱钙、石蜡包埋处理。将石蜡包埋的软骨组织切成5 μm 厚的切片，用二甲苯脱蜡，依次用不同浓度梯度的乙醇浸泡后蒸馏水洗净。
详细染色操作顺序如下：蒸馏水冲洗3 min，苏木精染色5 min,蒸馏水洗5 s，浸入1%盐酸-乙醇5 s，流水冲洗10 min，1%伊红染色2 min，蒸馏水洗净5 s。
切片进行常规处理(脱水和透明)，在显微镜下观察切片，倍数为10×10，参照改良Mankin评分[11]。
（1）软骨结构：光滑如常为0 分；
表面出现不规则裂隙为1 分；
裂隙深达移行层为2 分；
裂隙深达辐射层为3 分；
裂隙深达钙化层为4 分。
（2）软骨细胞：数量如常为0 分；
数量弥散性增多为1 分；
出现大量蔟集样细胞团块为2 分；
数量明显减少为3 分。（3）基质染色：正常为0 分；
染色轻度减退为1 分；
染色中度减退为2 分；
染色重度减退为3 分。
（4）潮线完整性：完整为0 分；
多重潮线为1 分；
软骨下血管侵入潮线为2 分。对软骨病理学改变进行评估，软骨病理改变程度与分数呈正相关。随后采集图片资料。
2.3.3 RT-PCR 法检测软骨中TLR4、MyD88、NFκB 的mRNA 表达水平 取各组冻存的膝骨关节炎软骨组织，采用RT-PCR 法进行检测TLR4、MyD88、NF-κB 的mRNA 表达。加入Trizol 试剂进行裂解，提取总RNA。再逆转录为cDNA，然后进行PCR 反应。PCR反应体系为：cDNA 模板2 μL，PrimerR（10 μmol）1 μL，PrimerF（10 μmol）1 μL，ddH2O 11 μL，2XSYBGREENPCRMasterMix 15 μL。PCR 反应条件为：95 ℃预变性5 min；
95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环40 次。
反应结束后采用2－ΔΔCt法计算各基因相对表达量。
引物序列见表1。
表1 兔引物序列
2.3.4 Western blot 法 检 测 软 骨 中TLR4、MyD88、NF-κB 的蛋白表达 取各组冻存的KOA 软骨组织，采用Western blot 法检测TLR4、MyD88、NF-κB 的蛋白表达。经剪碎、RIPA 裂解液裂解，以12 000 r/min离心15 min（离心半径6 cm）。
收集上清液，即为总蛋白液。
采用BCA 法检测蛋白浓度。
蛋白经变性后进行SDS-PAGE，转膜，转膜完毕后置入PBST 中洗净。将膜浸入脱脂奶粉封闭液，室温放置60 min，4 ℃过夜，次日室温放置30 min。
一抗孵育：5%脱脂奶粉稀释一抗，与膜在4 ℃下过夜孵育。
孵育完成后洗膜3次，每次10 min。二抗孵育：5%脱脂奶粉稀释二抗，与膜室温下孵育90 min。
孵育完成后洗膜3次，每次10 min。
显色与曝光：将膜置入ECL 化学发光液，孵育完成后用纸滤干，用化学发光成像仪拍照。
2.3.5 免疫组化检测软骨中的TNF-α、IL-1β、IL-6的含量 取各组冻存的膝骨关节炎软骨组织，采用免疫组化法检测TNF-α、IL-1β、IL-6 的含量。
予固定、脱钙、石蜡包埋处理，再切片，并用二甲苯脱蜡，不同浓度梯度的乙醇浸泡后蒸馏水洗净，进行抗原修复，再将切片浸入3%过氧化氢溶液5 min 来阻断内源性过氧化物酶，然后用缓冲液封闭。加一抗：将200 μL 兔一抗滴加到切片上，并在室温下孵育80 min。
加二抗：滴加80 μL 兔二抗，100 ℃孵育30 min。
DAB 显色：滴加适量DAB 显色剂，待反应完成后自来水洗涤。复染：将切片置入苏木素4 min，流水冲洗，PBS 返蓝。
脱水封片，显微镜下采集数据及图片。
2.4 统计学分析
采用SPSS 20.0 统计软件行数据分析。
计量资料以“±s”表示，若同时满足正态性和方差齐性，多组数据比较采用单因素方差分析，多组间两两比较用LSD 法；
若不满足正态性和方差齐性，采用非参数检验，Kruskal-Wallis 法。
P＜0.05 为差异有统计学意义。
3.1 膝关节软骨大体观察及Pelletier 评分结果
A 组：关节软骨颜色、光泽、厚度正常，软骨完整无损伤。B 组：关节软骨颜色灰白，无光泽，厚度明显变薄，表面凹凸不平，关节面承重区域软骨有明显破坏，甚至向下凹陷形成溃疡直至软骨深层，骨赘形成。C 组：关节软骨呈淡灰白色，光泽稍差，厚度稍变薄，关节软骨面部分区域表层软骨见少许破坏。
D组：关节软骨颜色发黄，光泽较差，厚度较薄，表面凹凸不平，关节面承重区域软骨有明显破坏，甚至向下凹陷形成溃疡直至软骨中层，有少量骨赘形成。
E组：关节软骨呈淡灰白色，光泽稍差，厚度稍变薄，关节软骨面部分区域粗糙。
F 组：关节软骨呈淡灰白色，光泽稍差，厚度稍变薄，关节软骨面部分区域粗糙。
详见图1。
图1 给药6 周后各组兔造模侧膝关节软骨大体观察结果
给药6 周后，与A 组比较，B 组Pelletier 评分增高（P＜0.01）；
与B 组比较，F 组Pelletier 评分降低（P＜0.05），C、D、E 组Pelletier 评分较B 组均有不同程度的降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。
详见图2。
图2 给药6 周后各组兔造模侧膝关节软骨Pelletier 评分结果
3.2 膝关节软骨HE 染色镜下观察结果
A 组：软骨HE 染色正常，无病理学改变。B 组：软骨显著变薄，表层软骨区域性缺失，软骨细胞数量显著减少并排列紊乱，可见血管入侵软骨基底层，软骨下骨质硬化。
C 组：软骨变薄，表层软骨有小的缺损，软骨细胞数量稍减少，部分软骨细胞呈簇聚状排列。D 组：软骨变薄，表层软骨部分区域破损，软骨细胞数量减少，部分软骨细胞呈簇聚排列。
E 组：软骨变薄，表层软骨有小的缺损，软骨细胞数量稍减少，排列大致正常。F 组：软骨变薄，表层软骨有小的缺损，软骨细胞数量稍减少，排列大致正常。
详见图3。
图3 给药6 周后各组兔造模侧膝关节软骨HE 染色结果（×100）
3.3 膝关节软骨Mankin 评分结果
给药6 周后，与A 组比较，B 组Mankin 评分增高（P＜0.01）；
与B 组比较，C、D、E、F 组Mankin 评分均降低（P＜0.01）。与C 组比较，E、F 组软骨Mankin评分稍低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。
详见图4。
图4 给药6 周后各组兔造模侧膝关节软骨大体观察的Mankin 评分结果
3.4 膝 关 节 软 骨 中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA的表达
给药6 周后，与A 组比较，B 组软骨组织中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA 表达水平均上调（P＜0.01）。
与B 组比较，C、D、E、F 组软骨组织中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA 表达水平均下调（P＜0.01）。详见图5。
图5 给药6 周后各组兔造模侧膝关节软骨组织中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA 的表达结果
3.5 膝关节软骨中TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白的表达
给药6 周后，与A 组比较，B 组软骨组织中TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白表达水平均上调（P＜0.01）；
与B组比较，C、D、E、F 组软骨组织中TLR4、MyD88、NFκB 蛋白表达水平均下调（P＜0.01）。
详见图6。
图6 给药6 周后各组兔造模侧膝关节软骨组织中TLR4、MyD88、NF-κB 蛋白的表达结果
3.6 膝关节软骨中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量
给药6 周后，与A 组比较，B 组的软骨细胞和软骨基质的IL-1β、IL-6 和TNF-α 染色结果均呈深黄棕色，累积光密度（IOD）值均升高，提示IL-1β、IL-6和TNF-α 含量均增高（P＜0.01）。
与B 组比较，C、D、E、F 组的软骨细胞和软骨基质的IL-1β、IL-6 和TNF-α染色结果均呈淡黄色，IOD 值均降低，提示IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量均降低（P＜0.01）。
详见图7～10。
图7 给药6 周后各组兔造模侧膝关节软骨组织中以免疫组化IOD 值表示的IL-1β、IL-6 和TNF-α 相对含量
图8 给药6 周后各组兔造模侧膝关节软骨组织中IL-1β 免疫组化染色结果（×400）
图9 给药6 周后各组兔造模侧膝关节软骨组织中IL-6 免疫组化染色结果（×400）
图10 给药6 周后各组兔造模侧膝关节软骨组织中TNF-α 免疫组化染色结果（×400）
KOA 是一种以关节疼痛、关节僵硬、关节肿胀、骨摩擦和关节无力为主要表现的退行性关节疾病[12]，中老年人群患病率高。KOA 属于中医学“痹病”的范畴，其中外感风寒湿邪致气血运行不畅，经脉痹阻，是此病重要的中医病机之一[13]。
追风透骨胶囊是追风透骨丸的改进剂型，具有通筋络、祛风寒、除湿邪、散寒邪、止痹痛的功效。其中，君药为川乌，药理学研究表明，川乌中的某些成分对单碘乙酸盐诱导的大鼠骨关节模型的关节软骨具有保护作用，其可预防关节软骨变性而降低Mankin评分，亦可促进软骨细胞增殖并抑制软骨细胞凋亡[14]。有研究表明，乌头提取液能抑制兔KOA 模型的关节软骨细胞外基质的异常降解，起到减缓软骨退变的作用[15]。
研究发现，其臣药之一赤芍所含的芍药苷可减少大鼠类风湿关节炎模型关节滑膜组织中IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎症因子的分泌，减缓类风湿关节炎疾病的进展[16]。
TLR4 是一种广泛存在于动物细胞膜表面的跨膜蛋白，属于10 种Toll 样受体中的一种[17]，可以诱导各种炎症因子的产生，参与介导炎症介质的释放[18]。MyD88 是动物细胞质中的一种可溶症衔接蛋白，接收来自Toll 样受体（包括TLR4）发出免疫信号，进行翻译整合后再向下游信号通路传导，是重要的免疫信号转导枢纽之一[19]。
NF-κB 是动物细胞质中的一种二聚体蛋白，能被TLR4/MyD88 信号通路传导的免疫信号激活，激活的NF-κB 将通过核孔转移至细胞核内，通过调控相关基因的转录和表达参与免疫炎症反应[20]。
因此，TLR4 表达的增加可能通过MyD88 激活NF-κB 信号转导，引发包括TNF-α、IL-1β和IL-6 在内的促炎性细胞因子的转录和合成，而TLR4/MyD88/NF-κB 信号转导通路持续被激活将导致过度的免疫炎症反应并最终造成组织损伤[21]。
近年来，Toll 样受体介导的软骨细胞的先天免疫反应已被证实是促进KOA 的关键环节[22]。研究发现，凋亡的软骨细胞TLR4 表达较正常软骨细胞明显增高，高表达的TLR4 会进一步激活其下游的MyD88及NF-κB 信号转导通路，诱导软骨细胞产生大量IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎症因子， 而过量的IL-1β、IL-6、TNF-α 是骨关节炎疾病中诱导关节软骨细胞凋亡的主要因素之一[23]，抑制软骨细胞TLR4 及其下游信号通路的活化，减少相关炎症因子的大量释放能有效抑制软骨细胞的凋亡，从而抑制KOA 发展[24]。
因此，TLR4/MyD88/NF-κB信号转导通路是研究KOA发病机制非常重要的环节。
本研究结果显示，与空白组比较，模型组膝关节软骨破坏明显，Pelletier 评分及Mankin 评分均升高(P＜0.01)；
软骨中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA 及蛋白表达水平均上调(P＜0.01),软骨中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量均升高(P＜0.01)。上述结果说明，KOA 模型兔患侧膝关节软骨中TLR4/MyD88/NF-κB 信号转导通路处于活化状态，并介导产生大量炎症因子，促进软骨细胞凋亡，从而促进KOA 的进展。
与模型组比较，追风透骨胶囊低、中、高剂量组及硫酸氨基葡萄糖组的软骨损伤程度轻，Mankin 评分均降低(P＜0.01)，软骨中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA 及蛋白表达水平均下调(P＜0.01)，软骨中IL-1β、IL-6、TNF-α含量均降低(P＜0.01)，此外，追风透骨胶囊高剂量组软骨Pelletier 评分降低明显(P＜0.05)。
结果说明，追风透骨胶囊及硫酸氨基葡萄糖能有效抑制关节软骨中TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路的活化，减少炎症因子产生，从而延缓KOA 的进展。
本研究将TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路相关指标作为检测对象，结果显示追风透骨胶囊可抑制该信号转导通路，但无法排除追风透骨胶囊是否可通过其他信号通路及途径来延缓KOA 的进展。相关研究表明，肠道中的某些革兰氏阴性菌大量繁殖后产生大量脂多糖，破坏肠道黏膜屏障的完整性，过量脂多糖经肠道吸收进入体内后会通过TLR4/MyD88/NF-κB 或TLR4/MyD88 非依赖/NF-κB 信号转导通路激活免疫炎症反应，导致组织损伤[25]。
所以，追风透骨胶囊对肠道菌群的调节，以及对肠壁黏膜屏障的作用和对TLR4 与脂多糖结合的干预有待进一步研究证实。
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