秦万昌，黄书奇，胡德庆
（天津医科大学基础医学院细胞生物学系，天津 300070）
染色质重塑复合物可以通过水解ATP释放能量，使组蛋白与DNA之间的构象发生改变，从而使暴露的DNA处于可以被结合的状态，达到调控基因表达的作用[1]。现已知共有4种染色质重塑复合物，分别为交换型转换缺陷和蔗糖不发酵型（yeast mating type switch/sucrose non-fermentable，SWI/SNF）染色质重塑复合物、模拟开关型（imitation switch，ISWI）染色质重塑复合物、解旋酶DNA结合型（chromodomain helicase DNA-binding，CHD）染色质重塑复合物、拟南芥型染色质重塑复合物（inositol auxotrophy，INO80）[2]。Smarcad1属于SWI/SNF家族，其可以通过水解ATP释放能量发挥染色质重塑的作用[3]。有报道指出，Smarcad1包含有一个ATP结合结构域以及双核定位信号[4-5]。因此在DNA复制过程中，Smarcad1能够维持染色质沉默状态[6]，在胚胎的早期发育中，其通过调节不同组蛋白修饰来维持胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESC）多能性[7]。获得较高纯度以及较大蛋白量的Smarcad1是对其生物学性质进行深入研究的关键。由于原核表达系统具有表达水平高、培养周期短、操作简单、抗污染能力强、经济性高等特点，因此是实验室蛋白质表达优先选择的表达系统。所制备的高质量蛋白能够被应用于多个方面，其中利用蛋白免疫动物制备特异性多克隆抗体能够很大程度上保证实验的可重复性。因此本文旨在通过构建原核表达质粒后使用原核系统对Smarcad1蛋白进行体外表达、分离与纯化，为Smarcad1蛋白相关的生物化学实验提供足量的高质量蛋白质，并利用此蛋白制备多克隆抗体，从而为揭示Smarcad1在早期胚胎发育过程中的作用机制奠定基础。
1.1 实验材料Rosetta感受态、DH5α感受态、pcDNA3.1-Flag-Smarcad1质粒、pET16b质粒为本实验室所保存。T4连接酶购买自TransGen公司，质粒小提试剂盒购自Vazyme公司。NdeⅠ限制性内切酶、XholⅠ限制性内切酶以及Western印迹显色试剂盒均购自Thermo公司。胶回收试剂盒购自Vazyme公司。鼠源、兔源IgG二抗购自Santa Cruz biotechnology。序列合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。氯化钠、酵母粉、蛋白胨均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。Ni-NTA购自BBI公司。考马斯R250购自索莱宝公司。抗体制备由武汉爱博泰克生物科技有限公司完成。293T、B16、V6.5细胞均为本实验室所保存，用于检测Smarcad1抗体在不同细胞系中的结合目的蛋白能力。
1.2 方法
1.2.1 构建重组表达质粒 确定合适的Smarcad1片段作为抗原片段，根据抗原预测选择Smarcad1的第1至132位氨基酸为目的片段，设计引物，上游引物：5′-GGAATTCCATATGATGAATCTTTTCAACTTGGA-3′，下游引物：5′-AAACTCGAGTCAGGATTCTTCATCTTCAGATG-3′，使用pcDNA3.1-Flag-Smarcad1质粒作为模板进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），产生一条约400 bp的目的条带，将此条带进行胶回收，使用NdeⅠ、XholⅠ对胶回收产物进行双酶切，对双酶切产物进行纯化回收。同时，使用NdeⅠ、XholⅠ对pET-16b载体进行双酶切，得到酶切产物后进行胶回收。将所得胶回收产物与酶切产物进行连接转化至DH5α感受态，37℃孵育过夜，待单克隆菌落形成后，挑菌至空LB培养基进行菌落PCR，鉴定出阳性菌液后，进行质粒小提，将所提质粒进行测序得到pET-16b-Smarcad1-F1质粒。
1.2.2 重组蛋白的原核表达与纯化 选择Rosetta感受态作为表达菌株，将pET-16b-Smarcad1-F1转化至Rosetta，待单克隆菌落形成后，挑菌至LB AMP+摇床中培养，37℃，220 r/min，7 h，菌液浑浊后，将菌液接种至500 mL LB AMP+摇床中培养，220 r/min，37℃，4 h，取1 mL菌液作为诱导前样本，4 h后，加入200 μmol IPTG进行诱导，设置摇床条件为16℃，12 h，220 r/min，诱导完成后取1 mL菌液作为诱导后样本。随后，离心收集全部菌体，加入裂解液，以30 s运行，30 s暂停，40%能量，总时间6 min进行超声，将超声后悬液离心，分离上清与沉淀。在上清中加入Ni-NTA进行孵育，2 h孵育结束后，离心收集镍珠，对镍珠清洗后进行洗脱，得到洗脱液（Elution1、Elution2、Elution3）。将洗脱液加入超滤管进行超滤，最终收集蛋白。
1.2.3 蛋白的检测与抗体制备 选择不同阶段的蛋白进行SDS-PAGE后进行考马斯亮蓝染色，将蛋白送至武汉爱博泰克生物科技公司，免疫实验动物（兔），约45 d后得到免疫前血清，以及含有Smarcad1特异性抗体的免疫后血清。
1.2.4 Western印迹检测抗体特异性 分别收集293T、B16、V6.5细胞蛋白，以及在V6.5中敲低Smarcad1的表达作为阴性对照，293T中过表达Smarcad1作为阳性对照，进行Western印迹检测：配制8%分离胶，4%浓缩胶的SDS-PAGE凝胶。加入1×Runnning Buffer没过玻璃板，在胶孔内加入一定量的蛋白液，利用电泳进行蛋白分离。蛋白电泳结束后，进行转膜，切去浓缩胶，制作转膜装置。加入1×Trans Buffer。转膜结束后，将膜做好标记，放于5%牛奶的TBST中，封闭1 h。随后清洗膜，配一抗，1∶2 000稀释抗体，将膜放于一抗4℃过夜。一抗后，使用TBST漂洗膜，置于摇床摇洗5 min，共3次。使用TBST配制二抗，1∶10 000稀释，敷二抗，室温，45 min。将膜置于摇床上用TBST漂洗5 min，3次。随后配制曝光液，将曝光液覆盖在膜表面，曝光，记录。
1.2.5 Co-IP检测抗体特异性 在293T细胞中转染pcDNA3.1-Flag-Smarcad1质粒，48 h后蛋白表达，收集细胞使用裂解液进行裂解，随后超声使蛋白充分释放，离心后收集上清，取一定量上清作为对照。在细胞上清中加入ProteinA/G beads，再分别加入IgG以及Smarcad1特异性抗体进行免疫共沉淀，4℃孵育，随后离心，分别收集沉淀，以Flag抗体进行Western印迹。
1.2.6 免疫荧光检测抗体特异性 在6孔板内接种一定量B16细胞，待细胞生长至80%愈合率后，使用4%多聚甲醛进行固定，随后，进行打孔透化以及BSA封闭，封闭结束后，使用Smarcad1抗体作为一抗进行孵育，一抗孵育结束后进行二抗孵育以及DAPI染色，封片，最后使用荧光显微镜进行拍照。
2.1 重组表达质粒pET-16b-Smarcad1-F1的构建 选取Smarcad1第1至132位氨基酸作为目的基因，进行PCR扩增，结果产生399 bp的目的片段（图1A），成功得到目的基因片段。利用XholⅠ、NdeⅠ对pET-16b载体进行双酶切，得到酶切产物，为一条约6 000 bp的目的条带（图1B），连接转化后进行菌落PCR鉴定，结果检测出多个阳性菌落克隆，目的条带位置符合预期（图1C）。表明重组表达质粒pET-16b-Smarcad1-F1构建成功。
图1 原核表达质粒pET-16b-Smarcad1-F1的构建Fig 1 Construction of prokaryotic expression plasmid pET-16b-Smarcad1-F1
2.2 Smarcad1蛋白的表达纯化 考马斯亮蓝染色后，结果显示相较于诱导前，诱导后产生明显目的蛋白，此蛋白在上清液与沉淀中均有分布，洗脱后，目的蛋白纯度明显增加，并且其分子量大小为27 kD，符合预期蛋白分子量，说明Smarcad1-F1蛋白成功诱导表达纯化，见图2。
图2 Smarcad1蛋白的表达纯化Fig 2 Expression purification of Smarcad1 protein
2.3 抗体特异性验证
2.3.1 Western印迹检测抗体特异性Western印迹验证制备的抗体能否结合目的蛋白，结果显示，相较于阴性对照组，此抗体能够识别B16细胞以及V6.5细胞中Smarcad1蛋白，不能识别293T细胞中目的蛋白，可能与293T细胞Smarcad1蛋白表达水平较低有关。此结果说明制备的目的抗体能够应用于Western印迹实验，且目的条带清晰（图3）。
图3 Western印迹检测抗体特异性Fig 3 Western blotting detection of antibody specificity
2.3.2 Co-IP检测抗体特异性 利用免疫共沉淀实验检测该目的抗体特异性，结果显示相较于IgG组，制备的目的抗体能够识别细胞内Smarcad1蛋白，成功沉淀出目的蛋白，说明此抗体可以与Smarcad1蛋白相互作用（图4）。
图4 Co-IP检测抗体特异性Fig 4 Co-IP detection of antibody specificity
2.3.3 免疫荧光检测抗体特异性 为进一步验证此目的抗体的特异性，在B16细胞中进行免疫荧光实验，结果显示Smarcad1抗体能够识别细胞内目的蛋白，荧光显微镜下呈绿色荧光，且此蛋白主要定位于细胞核内，表明此抗体能够特异性识别细胞内源性Smarcad1蛋白，再次验证了制备的Smarcad1抗体的特异性（图5）。
图5 免疫荧光检测抗体特异性Fig 5 Immunofluorescence detection of antibody specificity
胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）是一类具有自我更新以及发育多能性的细胞，最初由Evans等[8]从小鼠囊胚的内细胞团中分离而来，并且其可以发育成为包括生殖细胞在内的任何细胞[9]，虽然Samrcad1的表达贯穿细胞的整个发育阶段，但其表达的高峰主要集中于内细胞团以及囊胚阶段[10-11]，缺失了Samrcad1的细胞会表现出严重的形态学改变，并且使细胞倾向于逃离自我更新状态，展示了Samrcad1极强的对细胞发育过程的控制作用。在以往的报道中，Dongding等[12]发现Samrcad1通过其CUE domain与KAP1结合在Oct4、Nanog等多能性基因上，从而维持了mESC的多能性。内源性逆转录病毒是构成哺乳动物基因组的重要组成部分，Smarcad1同样能够与之结合发挥抑制作用[13]。因此已有充分证据表明Smarcad1作为一个多能性转录因子在ESC的早期发育中具有重要作用，但其对多能细胞染色质环境的调控仍知之甚少。
为进一步研究Smarcad1在胚胎发育过程中的作用机制，本研究利用原核表达系统体外表达纯化出Smarcad1蛋白，并成功制备出特异性较高的Smarcad1多克隆抗体。相较于单克隆抗体，多克隆抗体能够识别任一抗原上的多个表位，在抗体制备中成本相对低廉且制备速度较快，制备过程较单克隆抗体更加简单。并且由于多克隆抗体可识别多个表位，因此有利于蛋白质免疫共沉淀和蛋白质染色质免疫沉淀实验获得更好的结果[14-15]，这为后续检测Smarcad1在染色质上的结合情况打下良好基础，有利于研究Smarcad1在染色质水平所发挥的功能。而且实验室自己制备抗体除了可以弥补商品化抗体不足的缺点外，还能够保证在多次实验中所用抗体的一致性，排除了商品批号等问题带来的误差，提高了实验的可重复性，本研究也为后续实验室制备多种蛋白以及多克隆抗体提供借鉴。
综上所述，本研究基于Samrcad1在胚胎发育中具有重要作用，为了进一步探究其具体作用机制，在实验室条件下，利用原核表达系统纯化出纯度较高、免疫原性较好的目的蛋白。使用此目的蛋白制备多克隆抗体，具有特异性高、亲和能力强等优点，为进一步研究Samrcad1在不同领域中的作用奠定基础，同时也为其他蛋白的体外表达纯化提供了思路，通过这一方式，大大降低实验室消耗，稳定实验结果，有利于实验室长期发展。
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