赵泽广，李杰峰，张 宁，杨 威， 赵志强，孙艳玲，徐志媛，李 琴
（1.河北工程大学 生命科学与食品工程学院 056038；
2.河北省畜牧兽医研究所 071000；
3.河北农业大学动物医学院 071000）
金黄色葡萄球菌是自然界中常见的一种致病菌，无芽孢﹑鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性，可以引起严重感染[1-2]。近年来，金黄色葡萄球菌污染问题已经成为了世界范围内影响公共卫生与人类和动物健康的重大问题。欧盟一些国家中由金黄色葡萄球菌引起的细菌性食物中毒事件占食源性疾病事件的5%[3-4]。我国金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件已居第4位。随着抗生素种类越来越多，使用越来越频繁，金黄色葡萄球菌的耐药性越来越严重。蔡霞[5]等人对2018年7月～2021年3月淮南市某教学医院金黄色葡萄球菌临床分布及耐药性分析，结果显示在160株金黄色葡萄球菌中有69株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。洪小兰[6]等在中国人民解放军联勤保障部队第910医院2015年～2019年临床标本分离的1750株金黄色葡萄球菌中发现728株MRSA。
生鲜肉在动物屠宰﹑运输﹑储存和售卖过程中，由于操作﹑温度﹑环境等问题，金黄色葡萄球菌污染也很常见。阚浩鹏[7]等人在济南各类型市场的180份市售生鸡肉中检测到55株金黄色葡萄球菌。田璐[8]等人以中国知网2000年～2019年文献为基础统计了生鲜肉微生物污染情况，结果显示我国金黄色葡萄球菌在生鲜肉中检出率为10.81%。
耐药基因cfr是能够介导噁唑烷酮类药物﹑林可酰胺类药物﹑截短侧耳素类药物﹑氯霉素类药物以及链阳菌素A这五大类抗菌药同时耐药的多重耐药基因[9]。由于cfr可介导恶唑烷酮类药物—治疗耐药阳性菌最后一道防线，其已经成为抗生素治疗的严重威胁[10]。
1.1 材料
1.1.1 肉样
2022年采集的保定市售生鲜肉23份，其中猪肉8份，羊肉﹑牛肉4份，鸡肉7份。
1.1.2 主要试剂
营养肉汤﹑7.5%氯化钠肉汤﹑血平板﹑Baird-Parker琼脂基础﹑亚缔酸盐卵黄增菌液﹑冻干兔血浆均购自青岛海博生物技术有限公司；
比浊管购自比克曼生物科技有限公司；
药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；
快速基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；
M5 DL2000 DNA Maker﹑M5 DNA电泳用琼脂糖﹑2× M5 HiPer HiFi PCR mix均购自北京聚合美生物科技有限公司；
TSA（TSB与琼脂糖比例为4:3）琼脂为试验室配制。
1.2 方法
1.2.1 肉样处理 无菌采集适量肉样于1.5mL离心管中并加入200μL生理盐水，使用组织研磨器将其研磨至匀浆，再加入500μL生理盐水，振荡混匀，8000r/min离心5min。
1.2.2 细菌培养 取上清液接种于7.5%氯化钠肉汤中。37℃培养24h。
1.2.3 细菌分离 将培养的菌液接种于Baird-Parker平板上，37℃培养24h。挑取圆形﹑表面光滑﹑凸起﹑湿润﹑大小为2mm～3mm的具有光泽的灰黑色或黑色并伴有浅色边缘和不透明圈（沉淀）的菌落进行革兰氏染色，镜检记录菌体特征，挑选革兰氏阳性﹑成葡萄串状排列的球菌接种于血平板，培养24h。挑取圆形﹑光滑﹑凸起﹑金黄色（白色）﹑具有β溶血特征的菌落冻存，以备后续试验。
1.2.4 生化试验 将冻存的菌株复苏后接种于营养肉汤中，培养24 h。取培养物和无菌生理盐水分别接种于细菌微量生化鉴定管中，37℃培养24～72 h，观察记录结果。
1.2.5 血浆凝固酶试验 取营养肉汤培养物0.5mL于冻干兔血浆，轻轻震荡混匀，37℃培养，每半个小时观察一次，观察6 h，凝固则为金黄色葡萄球菌阳性。
1.2.6 药敏试验 将营养肉汤培养物浓度调至1.5×108CFU/mL，根据2021年美国临床和试验室标准化委员会标准（CLSI）进行种抗生素药敏试验，判读结果。
1.2.7 耐药基因检测 参照文献合成引物[11-13]（cfr﹑tetM﹑tetO﹑mecA﹑ermA﹑vanA﹑vanB），用分离菌培养菌液提取DNA进行耐药基因PCR扩增，扩增程序：95℃ 5 min，（94℃1 min，Tm 1 min，72℃ 1 min）×35循环，72℃终延伸10 min。扩增产物使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
表1 金黄色葡萄球菌耐药基因引物序列
2.1 细菌的分离培养
采集保定市售生鲜肉23份，进行金黄色葡萄球菌分离鉴定，结果显示有1株从鸡肉中分离的细菌表现出金黄色葡萄球菌典型特征。分离菌在Baird-Parker平板上长势良好（图1），表面凸起，光滑湿润，具有光泽，颜色黑色，同时伴有浅色边缘和不透明光圈。血平板培养基上菌落较大，表面光滑，白色，凸起并伴有β溶血环。挑取单个菌落进行革兰氏染色镜检（图2），结果显示该分离菌呈葡萄串状或链状排列的圆形球菌。
图1 分离菌菌落特征
图2 分离菌革兰氏染色
2.2 生化试验结果
分离菌可分解葡萄糖﹑麦芽糖﹑乳糖﹑蔗糖﹑精氨酸﹑尿素﹑淀粉，甲基红反应阳性，V-P试验阳性，液化明胶，可在高盐肉汤中生长。
表2 生化试验结果
2.3 药敏试验结果
药敏结果显示（表3），该菌只对万古霉素﹑利奈唑胺敏感，对头孢曲松钠﹑左氧氟沙星﹑卡那霉素中介，对头孢噻肟﹑氨苄西林﹑四环素﹑林可霉素﹑阿奇霉素﹑环丙沙星耐药，表现出多重耐药。
表3 药敏试验结果
2.4 耐药基因检测结果
2.4.1 耐药基因cfr检测结果 耐药基因cfr检测结果显示为阳性（图3），目的条带为746 bp。
图3 cfr耐药基因检测结果
2.4.2 其他耐药基因检测结果 （图4）显示，该菌株携带耐药基因tetM，其目的条带为406 bp。
图4 耐药基因检测结果
随着我国社会的发展，食品安全已经成为了社会关注度较高的问题，金黄色葡萄球菌作为食品中第二大致病菌[14]，对其监测尤为重要。周勇[15]等对2009年～2018年广州市即食食品中金黄色葡萄球菌进行检测，从1399份食品中分离出157份阳性菌株，分离率为11.22%。2015年秦磊[16]等人对唐山市10个县区不同场所的217份食品进行金黄色葡萄球菌检测，阳性率为15.2%。
近年来，国内外对金黄色葡萄球菌耐药性的研究越来越多，但是对携带cfr耐药基因的金黄色葡萄球菌研究较少，这可能因为cfr耐药基因检出率较低。
多数抗生素通过与细菌核糖体结合，抑制细菌蛋白质合成来达到抑菌效果[17]。但是，多重耐药基因cfr通过编码RNA甲基转移酶，对23S核糖体RNA的2503位嘌呤残基进行修饰，从而降低抗生素与细菌核糖体的肽基转移酶中心的亲和力，导致细菌对某些抗生素产生耐药性[18]。另外，cfr基因是迄今为止唯一由包括质粒在内的可移动元件介导的恶唑烷酮类耐药基因[19]，然而恶唑烷酮类抗生素利奈唑胺作为临床上治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌﹑耐万古霉素肠球菌和耐青霉素肺炎球菌最后一道防线[20]，cfr基因可以使细菌对其产生耐药性。因此，携带cfr耐药基因的细菌传播对公共卫生安全形成了巨大隐患。cfr 多重耐药基因陆续在包括动物源和人源的葡萄球菌﹑肠球菌﹑巨型球菌﹑大肠埃希氏菌和变形杆菌等革兰氏阳性和阴性菌株中均有报道[21-24]。尤其是在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素金黄色葡萄球菌中更为常见[18]，且携带cfr的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌临床治疗的难度更大[25]。
本研究从保定市售生鲜肉中分离到一株携带cfr耐药基因的金黄色葡萄球菌，但是mecA基因检测结果为阴性，证明该菌不是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。分离菌对6种抗生素表现为耐药，3种抗生素表现为中介，出现了多重耐药的情况，但是万幸的是该菌对万古霉素和利奈唑胺敏感。其他耐药基因检测结果显示，分离菌携带有tetM耐药基因，药敏试验中分离菌对四环素表现出耐药，耐药表型与耐药基因检测结果一致。
本试验从保定市售生鲜肉中分离得到了一株携带cfr耐药基因的金黄色葡萄球菌，具有严重的多重耐药性，且同时携带tetM耐药基因，本株多重耐药金黄色葡萄球菌对生鲜肉市场公共卫生安全具有一定风险。
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