周朝阳 王韶 罗亚灿 周贤用 董服波 李西*
先天性心脏病是最常见的先天性畸形之一，其临床表现主要取决于畸形的大小和复杂程度［1］。研究先天性心脏病的发病机制，对于提前预防、诊断和治疗具有重要的作用。斑马鱼因其基因保守、体外受精、胚胎透明、具有一心房一心室等生理特点，已成为研究心脏发育的重要模式动物［2］。在斑马鱼胚胎发育过程中，心肌前体细胞可以在囊胚期检测［3］，一些早期的标记基因如nkx2.5［4］，hand2［5］，cmlc［6］等特异度表达在此区域。蛋白激酶C（PKC）是一个丝氨酸和苏氨酸特异度蛋白激酶家族，在多种的细胞活动中发挥重要作用，如调控细胞周期等。PKCα 是心肌细胞中主要表达的PKC 亚型，对Ca2+有强烈的依赖，是心肌细胞生长的调节因子［7］，在心脏发育和许多心血管疾病的病理生理学中起着多方面的作用，其中PKCα 是心肌细胞收缩力的重要调节因子［8］。胚胎致死性异常视觉样蛋白1（embryonic lethal abnormal vision like 1，ELAVL1）是一种广泛表达的RNA 结合蛋白，主要通过调控靶mRNA 的稳定性和翻译效率来调控相应基因的翻译表达［9］，对个体的发育存活和器官的形成起着重要作用。Elavl1+/-小鼠交配产生的纯合Elavl1-/-老鼠在胚胎发育至14.5 d前全部死亡［10］。全身条件性敲除的成年小鼠因间接上调p53的表达导致多器官中前体细胞凋亡而死亡［11］。研究证实PKC 能通过磷酸化ELAVL1 的Ser158 与Ser221位点诱导ELAVL1 核质穿梭，而突变上述磷酸化位点会阻断ELAVL1 的核质穿梭过程，显著性降低细胞质中ELAVL1 含量［12］。上述研究提示PKC 可能通过介导ELAVL1 磷酸化，影响靶基因的稳定性，进而调控胚胎发育的正常进行。笔者既往的研究显示，斑马鱼中存在两个 elavl1 基因亚型，其中起主要作用的是elavl1a［13］。因此，笔者拟以斑马鱼为研究对象，观察PKC 对elavl1a的影响及与斑马鱼的心脏发育的关系。
1.1 斑马鱼的饲养 成年斑马鱼在28±1℃的光/暗周期中饲养14 h/10 h，并喂以丰年虾。斑马鱼胚胎在E3 溶液（0.25 M NaCl、0.0085 M KCl、0.0165 M CaCl2·H2O、0.0165 M MgSO4·7H2O）中于28℃±1℃下饲养。所有动物实验均符合温州医科大学机构动物护理和使用委员会的指导原则。
1.2 主要试剂 Trizol 试剂、逆转录试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix、Lipofectamine2000、Lipofectamine LTX and Plus 试剂购于美国Invitrogen 公司；
Vinculin 单克隆抗体、elavl1a 多克隆抗体购于美国Abcam 公司；
ECL 显影液购于美国Millipore 公司；
山羊抗兔IgG HRP抗体购于美国Jackson 公司；
PCR 试剂盒购于北京天根公司；
RIPA 蛋白裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒购于上海碧云天公司；
引物合成于南京金斯瑞公司；
抗地高辛AP，BCIP/NBT 储备溶液购于瑞士Roche 公司；
星形孢菌素，卡马拉素，Go6976 购于上海MCE 公司。
1.3 药物实验 使用胚胎培养液将星形孢菌素，卡马拉素，Go6976 原液稀释至对应浓度。去除原有胚胎培养液，加入含有DMSO 或药物的胚胎培养液；
放置于28℃胚胎培养箱培养，48 h 后取出做后续实验。
1.4 原位杂交 使用标记有抗地高辛AP 的单链RNA探针进行全套原位杂交。将固定和分期的胚胎预杂交3 h，然后与指示探针杂交过夜。经过一系列严格的清洗后，胚胎被2%的牛血清白蛋白封闭，并与碱性磷酸酶结合抗体孵育过夜。用洗涤液洗涤后，用BCIP/NBT储备溶液标记样品。
1.5 显微注射 设计特异度敲降斑马鱼elavl1a 的寡聚核苷酸，具体序列如下所示：elavl1a MO：TGTGGTCTTCGTAACCGTTCGACAT。DEPC 水 稀 释elavl1a MO 至2 ng/nL 与4 ng/nL，阴性对照组注射等量DEPC 水。显微注射仪压力阀调节氮气压力，校准注射压力及注射时长，使单次注射体积固定为2 nl，将稀释所得MO/对照组MO 注入注射针，调整位置。斑马鱼产卵后5 min 内收集受精卵，将鱼卵单个排列贴于凹槽，使用毛细管将胚胎摆放至动物极朝向注射针相对位置，便于注射。将MO 依次快速注入斑马鱼胚胎（1-2 细胞期），显微注射后的斑马鱼胚胎移回培养皿，28℃培养箱培养。显微注射后12 h 挑除未受精或死亡胚胎。
1.6 Western Blot 收集显微注射后斑马鱼胚胎，加入1 mL 去卵黄液，室温摇床快摇15 min，离心机常温，300 g，离心30 s。去除上清液，沉淀中加入50μL RIPA细胞裂解液 （含有0.1%蛋白酶抑制剂、0.1%磷酸酶抑制剂），置于冰上30 min，离心机4℃，15,000 rpm，离心10 min。收集上清，-80℃保存备用。使用BCA 试剂盒检测总蛋白浓度。将样品加到SDS-PAGE 凝胶上分离，并转到PVDF 膜上，PVDF 膜室温下用5.0%牛奶封闭2 h，PBST 洗膜三次，每次5 min，随后与2%BSA 稀释的一抗4℃孵育过夜。第二天用PBST 洗膜三次，将膜与相应二抗室温下孵育1 h。调整曝光度曝光拍照，使用ImageJ 软件进行条带灰度值定量分析。
1.7 实时荧光定量PCR 使用Trizol 试剂提取总RNA， 分 光 光 度 计 测RNA 浓 度 和 纯 度。
将RNA 通 过 使 用 PrimeScript™ RT Master Mix 逆 转 录成cDNA。
使 用 SYBR® Premix Ex Taq™试 剂 通 过实时荧光定量PCR 进行定量。相对转录水平通过2-ΔΔCT法进行数据分析。Nkx2.5 引物序列：前引物：5’-AGCATCCAACCTTCACAGTCC-3’；
后 引 物：5’-AAAAACAT CCCAGCCAAACC-3’；
EF-1α 用 作内参，前引物：5’-CTGGAGGCCAGCTCAAACAT-3’；
后 引物：5’-ATCAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCATT AC-3’。
1.8 统计学方法 采用Prism 6 统计软件。计量资料符合正态分布以（±s）表示，采用t检验。图像分析软件使用Image J 进行分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 抑制斑马鱼体内PKC 活性后胚胎心脏发育异常 Staurosporine、Rottlerin、和Go6976 均为常用的PKC 抑制剂，其中Staurosporine 是广谱的PKC 抑制剂，Rottlerin 是PKCɑ 抑制剂，Go6976 是PKCδ 抑制剂。通过在斑马鱼胚胎培养液中添加Staurosporine（1μM），Rottlerin（50μM）和Go6976（2.5μM）抑制胚胎体内相应PKC 活性，持续暴露48 h。随后通过整胚原位杂交检测心肌细胞标记物cmlc 的表达，显示使用这些PKC抑制剂处理后的胚胎心脏发育畸形显著增加（见图1）。
图1 PKC抑制剂处理导致斑马鱼胚胎心脏发育异常。A. PKC抑制后，原位杂交实验显示胚胎心脏发育异常；
B. PKC抑制后胚胎心脏发育统计结果，其中Rottlerin组和Staurosporine组的异常率最高，其次为Go6976组
2.2 elavl1a 的Ser219 与Ser316 位点突变对心脏发育的影响 为了探究elavl1a 是否与胚胎心脏发育有潜在联系，突变elavl1a 的Ser219 和Ser316 磷酸化位点，同时注射不同形式的flag-elavl1a mRNA 进入胚胎，Western blot 验证显示 elavl1 蛋白表达水平升高。与对照组相比，整胚原位杂交检测心肌细胞标记物cmlc 的表达显示 elavl1a Ser219 和Ser316 位点突变的斑马鱼胚胎心脏发育出现异常（见图2）。
图2 elavl1a点突变可导致斑马鱼胚胎发育异常。A. 不同形式elavl1a-flag mRNA注射后 elavl1a蛋白表达水平明显增加；
B. 注射后，原位杂交实验显示点突变的elavl1a导致胚胎心脏发育异常；
C. elavl1a点突变后胚胎发育统计结果
2.3 elavl1a 调控斑马鱼早期心脏的发育 nkx2.5 在心脏发育期间发挥着重要作用，也是胚胎发育阶段心脏系统中表达较早的基因之一。通过生物信息学工具分析发现在nkx2.5 的3’非编码区存在三个 elavl1a 潜在结合位点（见图3A），因此推测nkx2.5 可能是 elavl1a 的潜在靶基因。首先通过显微注射寡聚核苷酸特异度敲降elavl1a 表达，与对照组相比，敲降组斑马鱼nkx2.5 表达量显著降低（见图3B），且心脏发育出现异常（见图3C）。
图3 elavl1a调控斑马鱼早期心脏的发育 。A. 斑马鱼nkx2.5 3’非编码区存在elavl1a三个潜在结合位点；
B. 敲降elavl1a后nkx2.5的表达量显著下降；
C. 敲降elavl1a后心脏发育出现异常表型
先天性心脏病发病率在我国发病率较高，统计显示我国每年新增先天性心脏病婴儿15～20 万。本文通过抑制PKC 活性及敲降elavl1a 表达发现斑马鱼心脏发育出现异常，且elavl1a 可能是通过影响nkx2.5 基因的表达而调控斑马鱼胚胎心脏发育。
PKC 作为蛋白激酶家族成员之一，在细胞的增殖和分化中起着关键作用，参与心脏形成过程以及心脏病发病过程，其中尤以PKCɑ 为主要亚型。广谱抑制PKC 活性或主要抑制PKCɑ，均可影响斑马鱼胚胎心脏发育，幼鱼心脏畸形显著增加。
笔者既往的研究已经发现，PKC 可以介导elavl1 的Ser219 与Ser316 位点磷酸化，促进elavl1 的核质穿梭，从而发挥相应的功能。在人髓系白血病细胞K562 中，转染过表达ELAVL1 的Ser219 位点和Ser316 位点突变载体后，氯高铁血红素诱导的ELAVL1 核质穿梭受到抑制，从而抑制了人髓系白血病细胞的分化［15］。在本研究中突变了elavl1a 被PKC 调控的磷酸化位点——Ser219和Ser316，显示斑马鱼幼鱼心脏发育更容易出现畸形。nkx2.5 已被验证是与人类多种心脏疾病相关［16］，且对维持斑马鱼心室同一性至关重要［17］。本研究发现在敲降elavl1a 斑马鱼中nkx2.5 表达量显著降低，且nkx2.5上存在elavl1a 三个潜在结合位点，提示elavl1a 可能是通过调控nkx2.5 表达而影响斑马鱼幼鱼心脏发育。
综上所述，本研究发现抑制PKC 或敲降elavl1a 都能导致斑马鱼胚胎心脏发育畸形，这一病理过程可能是elavl1a 通过调控nkx2.5 的表达而实现，说明PKC 与elavl1 对斑马鱼胚胎心脏发育具有重要的调控作用。
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