陈茹 刘洪伯 马丽丽
(新疆维吾尔自治区人民医院肿瘤科，新疆 乌鲁木齐 830011)
结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)是全球第三大常见的癌症类型，致死率也位居全球第三位，每年造成约7万例患者死亡[1]。随着人们饮食和生活方式的变化，CRC发病率也呈上升趋势。尽管近几十年来CRC的诊断和治疗均取得了一定进展，但尚未开发出有效的方法来治疗晚期转移性CRC，据统计，局部CRC患者的5年生存率为80%，而远处转移患者的5年生存率仅为10%～20%[2]。目前，基于手术的综合治疗仍是晚期CRC治疗的最佳策略，其中常用的一线化疗药物包括氟尿嘧啶、亚叶酸钙和奥沙利铂等[3-4]，但这些药物的长期重复使用会导致耐药性产生，从而限制了其临床应用。基质细胞衍生因子-1(Stromal cell-derived factor-1，SDF-1)，也称为CXC趋化因子配体12(CXCL12)，是一类具有强大趋化潜能的稳态细胞因子，与跨膜G蛋白偶联受体CXCR4相互作用，参与一系列生理和病理过程，例如参与多种组织器官发育、细胞生长、肿瘤进展、血管生成及转移[5-6]。AMD3100是SDF-1/CXCR4轴的特异性拮抗剂，通过特异性的与CXCR4结合抑制SDF-1/CXCR4轴之间的相互作用，进一步阻断该轴参与的生理和病理过程，并且与其他趋化因子受体无交叉反应[7]。目前，靶向SDF-1已经成为多种实体瘤的治疗策略之一，本研究旨在探讨通过AMD3100靶向SDF-1阻断SDF-1/CXCR4轴后对结直肠癌化疗敏感性的影响及其作用机制，以期为结直肠癌的治疗提供一种新思路。
1.1 实验动物 健康SPF级BALB/c裸鼠30只，4周龄，体质量18～20 g，饲养于新疆医科大学实验动物中心，温度为22～25℃，相对湿度为40%～60%，每日光照/黑暗交替各12 h，期间自由饮水与饮食。本研究通过医院动物伦理委员会审核通过。
1.2 主要材料与试剂 人结直肠癌细胞系LoVo和人单核细胞系THP-1购自购于中国科学院上海细胞库。胎牛血清购自杭州四季青；
青霉素-链霉素双抗、RPMI-1640培养基购自美国Hyclone公司；
佛波酯(PMA)、白细胞介素-4(IL-4)、奥沙利铂(Oxaliplatin)和SDF-1抑制剂AMD3100购自美国Sigma公司；
Trizol试剂购自美国ThermoFisher Scientific公司；
M-MLV反转录试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司；
SYBR®Premix Ex TaqTMII试剂盒购自日本Takara公司；
CCK-8试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒及ECL发光液购自上海碧云天生物研究所；
免疫组织化学染色试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；
APC标记CD86抗体、PE标记CD206抗体、eFluor 450 标记F4/80抗体、APC标记CD11c抗体以及兔抗人SDF-1、iNOS、Arg-1抗体购自英国Abcam公司；
兔抗人GAPDH抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物有限公司。其他使用试剂均为国产分析纯。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养与诱导 将冻存的LoVo细胞浸入37℃水浴锅复苏后，加入适量含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的RPMI-1640培养基，于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内常规培养。在THP-1细胞中添加RPMI-1640培养基培养，调整密度为1×106个/mL，吸取100 μL接种于6孔板中，每孔加入20 ng/mL PMA，于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内培养3 d，诱导细胞贴壁分化为M0型巨噬细胞，再换用20 ng/mL IL-4继续培养72 h，诱导获得TAMs细胞。
1.3.2 流式细胞术 收集诱导后的TAMs细胞，PBS洗涤细胞并重悬，并在细胞悬液中加入等体积血清，于室温下封闭30 min，接着加入APC标记CD86抗体与PE标记CD206抗体，于4℃暗室反应30 min，PBS洗涤细胞后再次重悬，通过流式细胞仪检测细胞表面CD86和CD206表达情况。
1.3.3 实时荧光定量PCR 使用5 μg·mL-1SDF-1抑制剂AMD3100处理TAMs细胞24 h后，收集细胞，PBS洗涤细胞。Trizol试剂分别提取TAMs细胞与SDF-1抑制剂AMD3100处理后TAMs细胞的总RNA，紫外分光光度计检测总RNA纯度与浓度，选择OD260/OD280值在1.8～2.0间的样品，按照M-MLV反转录试剂盒说明书将总RNA逆转录为cDNA，再以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增实验检测各基因在mRNA上的表达水平，具体根据SYBR®Premix Ex TaqTMII试剂盒说明书操作，设内参基因为GAPDH。扩增条件为：95℃ 3 min，1个循环；
95℃ 30 s、60℃ 30 s、58℃ 30 s，40个循环，根据2-ΔΔCt法计算各基因mRNA相对表达量。引物具体序列如下：SDF-1上游引物5′-CCTGTGTGTCATGCCCTCTT-3′，下游引物5′-AGTCCAGCCTGCTATCCTCA-3′；
iNOS上游引物5′-ATGACTGAATATAACTTGTG-3′，下游引物5′-GAGAAGGACAAGAAAGCC-3′；
TNF-α上游引物5′-TCTTCTCATTCCTGCTTGTG G-3′，下游引物5′-GGTCTGGGCCATAGAACTGA-3′；
Arg-1上游引物5′-AGGGCAGAGTCAAGATGA AC-3′，下游引物5′- TGTGGTTGTCAGTGGAGCT TG-3′；
TGF-β上游引物5′-ACCTCGGCTGGAAGT GGATC-3′，下游引物5′-CCTTGCTGTACTGCGTG TCC-3′；
GAPDH上游引物：5′-AACGGATTTGGTC GTATTG-3′,下游引物：5′-GGAAGATGGTGATGG GATT-3′。
1.3.4 蛋白质免疫印迹 在经AMD3100处理和未处理的TAMs细胞中加入RIPA裂解缓冲液提取总蛋白，BCA法测定总蛋白质质量。制备10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶，取蛋白样品等量上样，通过电泳分离蛋白质，将分离的蛋白转移至聚偏氟乙烯膜，加入5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST洗膜，加入兔抗人SDF-1抗体(1∶1000)，设内参蛋白为GAPDH(1∶1000)，4℃下共同孵育过夜；
次日，弃去一抗工作液，TBST洗膜，加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶5000)，室温孵育1 h，TBST再次洗膜，ECL化学发光液显色曝光，凝胶成像系统拍照，Image J软件分析蛋白条带的灰度值。
1.3.5 共培养体系的建立与实验分组 取对数生长期的LoVo细胞和经不同处理的TAMs细胞，将LoVo细胞以5×104个的密度接种在Transwell小室的6孔板底部，将TAMs细胞以1×105个的密度接种在Transwell小室的上层，分别加入适量新鲜培养基，以建立LoVo细胞与TAMs细胞的共培养体系。实验分组包括空白对照组、奥沙利铂组(使用不同浓度0、0.5、5、50、500 μmol/L奥沙利铂处理LoVo细胞48 h)，TAMs+奥沙利铂组(LoVo细胞与TAMs细胞共培养，再用0、0.5、5、50、500 μmol/L奥沙利铂处理LoVo细胞48 h)，AMD3100+TAMs+奥沙利铂组(使用5 μg·mL-1SDF-1抑制剂AMD3100预先处理TAMs细胞24 h再与LoVo细胞共培养，之后使用0、0.5、5、50、500 μmol/L奥沙利铂处理LoVo细胞48 h)。
1.3.6 CCK-8法 收集奥沙利铂组、TAMs+奥沙利铂组、AMD3100+TAMs+奥沙利铂组LoVo细胞，根据CCK-8试剂盒分别检测细胞增殖活性，各组设置6个复孔，在每个细胞孔中加入10 μL CCK-8试剂液，轻轻混匀，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱继续培养2 h，通过酶联免疫检测仪测定450 nm处各孔光密度值(OD值)。
1.3.7 动物移植瘤模型建立 取生长状态良好的LoVo细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，吹打呈单细胞悬液，以4000 rpm/min离心10 min，弃上清，并用适量的RPMI 1640培养基重悬细胞，调整细胞悬液密度为1×107个/mL，取30只BALB/c裸鼠，并吸取0.5 mL的细胞悬液注射到裸鼠右侧腋窝皮下，观察注射部分移植瘤长出情况。待肿瘤长出，取12只肿瘤大小为100 mm3的模型裸鼠，将其根据随机数字表法分为3组，包括对照组、奥沙利铂组、AMD3100+奥沙利铂组，每组4只，奥沙利铂组腹腔注射8 mg/kg奥沙利铂，AMD3100+奥沙利铂组腹腔注射5 mg/kg SDF-1抑制剂AMD3100和8 mg/kg奥沙利铂，对照组同时注射等体积生理盐水，每日一次，持续18 d。首次给药后，在第0、3、6、9、12、15、18 d使用游标卡尺测量各组裸鼠肿瘤块的长径和短径，计算肿瘤体积V=1/2×肿瘤长径×肿瘤短径2。末次给药后，脱颈椎处死各组裸鼠，解剖取其肿瘤组织并称重，固定在10%福尔马林溶液中备用。
1.3.8 不同亚型巨噬细胞分选 将裸鼠肿瘤组织切成大约1 mm3小块，加入裂解液置于冰上孵育30 min，通过细胞裂解仪处理，再经过滤、离心、重悬的步骤制备单细胞悬液。PBS洗涤细胞，调整细胞悬液密度为1×107个/mL，吸取90 μL移至无菌离心管中，加入10 μL eFluor 450抗鼠F4/80抗体，分选F4/80阳性细胞后，再次加入10 μL APC标记CD11c抗体和10 μL PE标记CD206抗体，进行二次分选。在F4/80阳性基础上，CD11c阳性为M1型巨噬细胞，CD206阳性为M2型巨噬细胞，通过流式细胞仪进行分析。
1.3.9 免疫组织化学染色 取固定好的肿瘤组织制备常规石蜡切片，厚度为4 μm，切片置于烤箱高温处理1 h后，脱蜡脱水，蒸馏水浸洗，使用柠檬酸钠对切片进行抗原修复，滴加3%过氧化氢，室温孵育10 min，PBS冲洗切片，滴加稀释的10%山羊血清封闭45 min，清除切片周围的液体，加入兔抗人iNOS(1∶100)抗体、兔抗人Arg-1抗体(1∶100)，4℃冰箱内孵育过夜；
次日，弃一抗工作液，PBS 冲洗切片，加入HRP的山羊抗兔IgG(1∶1000)，室温孵育1 h。PBS再次冲洗切片，滴加DAB显色液，流水冲洗，Harris苏木素复染1 min，1%盐酸酒精分化，自来水水洗返蓝，再将切片进行程序化脱水、透明，置于通风橱晾干，中性树胶封片，在光学显微镜下观察并计数细胞阳性表达，阳性表达为胞质着色棕黄色至棕色，随机选择6个视野，计算目的蛋白的阳性表达率。
2.1 TAMs细胞的鉴定 通过倒置显微镜观察THP-1细胞形态变化，观察到诱导前细胞形态为规则圆形，边缘清晰，呈悬浮状，未附着在培养皿底部；
经过PMA、PMA+IL-4诱导后细胞贴壁生长，细胞形态不规则，颗粒较大，为混合圆形或纺锤形，细胞突起较明显，见图1。流式细胞术检测结果表明，与诱导前细胞比较，PMA+IL-4诱导后的细胞中M1型巨噬细胞表面标记物CD86表达水平明显减少，同时M2型巨噬细胞表面标志物CD206表达水平明显增加，见图2。
图1 倒置显微镜观察细胞形态(100×, 50 μm)
图2 流式细胞术检测诱导前后细胞中CD86和CD206表达
2.2 各组TAMs细胞中SDF-1表达比较 qRT-PCR和Western blot检测结果显示，与未经SDF-1抑制剂AMD3100处理的TAMs细胞比较，经过SDF-1抑制剂AMD3100处理的TAMs细胞中SDF-1 mRNA相对表达量与蛋白相对表达量均显著下调(P<0.01)，说明TAMs细胞中SDF-1表达受到抑制，见图3。
图3 TAMs细胞SDF-1表达检测
2.3 各组TAMs细胞中iNOS、TNF-α、TGF-β及Arg-1表达比较 qRT-PCR检测结果显示，与未经SDF-1抑制剂AMD3100处理的TAMs细胞比较，经过SDF-1抑制剂AMD3100处理的TAMs细胞中iNOS mRNA和TNF-α mRNA的相对表达量均显著升高(P<0.01)，TGF-β mRNA和Arg-1 mRNA的相对表达量则显著降低(P<0.01)，见图4。
图4 qRT-PCR检测两组TAMs细胞中iNOS、TNF-α、TGF-β及Arg-1表达
2.4 各组LoVo细胞化疗敏感性比较 CCK-8检测结果显示，经不同浓度(0.5、5、50、500 μmol/L)奥沙利铂处理LoVo细胞后，细胞存活率较空白对照组(0 μmol/L)均显著下降(P<0.01)，见图5。经不同浓度(0.5、5、50、500 μmol/L)奥沙利铂处理后，CCK-8检测结果显示，与奥沙利铂组比较，TAMs+奥沙利铂组LoVo细胞存活率显著升高(P<0.01)；
与TAMs+奥沙利铂组比较，AMD3100+TAMs+奥沙利铂组LoVo细胞存活率显著下降(P<0.01)，见表1。
表1 不同浓度奥沙利铂对各处理组LoVo细胞存活率的影响
图5 CCK-8检测经奥沙利铂处理的LoVo细胞存活率
2.5 各组裸鼠肿瘤生长比较 裸鼠首次给药后，在第6、9、12、15、18 d时经过测量发现，奥沙利铂组和AMD3100+奥沙利铂组的裸鼠肿瘤体积均较对照组显著下降(P<0.01)，且在第12、15、18 d时，相较于奥沙利铂组，AMD3100+奥沙利铂组的裸鼠肿瘤体积进一步下降(P<0.01)，见图6A；
在18 d后取各组裸鼠肿瘤组织，可见奥沙利铂组和AMD3100+奥沙利铂组裸鼠的肿瘤块和重量均小于对照组(P<0.01)，同时AMD3100+奥沙利铂组较奥沙利铂组也显著减小(P<0.01)，见图6B、C。
图6 各组裸鼠肿瘤生长情况
2.6 各组裸鼠肿瘤组织中M1、M2 亚型巨噬细胞比例比较 流式细胞术检测结果显示，与对照组比较，AMD3100+奥沙利铂组裸鼠肿瘤组织中M1亚型巨噬细胞标记物F4/80+CD11c+表达显著增加(P<0.01)，M2亚型巨噬细胞标记物F4/80+CD206+表达显著减少(P<0.01)，而奥沙利铂组较对照组差异无统计学意义(P>0.05)，见图7。
图7 流式细胞术检测肿瘤组织M1、M2 亚型巨噬细胞比例
2.7 各组裸鼠肿瘤组织中iNOS和Arg-1表达比较 免疫组织化学染色检测结果显示，AMD3100+奥沙利铂组裸鼠肿瘤组织中iNOS阳性表达率较对照组显著升高(P<0.01)，Arg-1阳性表达率较对照组显著下降(P<0.01)，而奥沙利铂组和对照组的肿瘤组织中iNOS阳性表达率和Arg-1阳性表达率之间差异均无统计学意义(P>0.05)，见图8。
图8 免疫组织化学染色检测肿瘤组织中iNOS和Arg-1表达(100×)
CRC全球每年约有136万例新增病例，是导致人类癌症死亡的主要原因之一，严重威胁着人类的健康[2]。目前，手术切除仍是CRC治疗最有效的方法，但化学疗法也是术后辅助治疗和转移性癌症治疗中不可缺少的。而在化学药物治疗过程中产生的副作用，包括神经毒性和胃肠道毒性，会显著影响患者的生活质量[8]。另外，许多患者在化学药物治疗过程中表现出了明显的耐药性。因此，迫切需要探索新策略以增强肿瘤细胞的化疗敏感性。
奥沙利铂属于第三代铂化合物，能够诱导癌细胞中链内鸟嘌呤-鸟嘌呤和鸟嘌呤-腺嘌呤DNA连接的形成，以DNA为作用的靶部位，使铂离子与DNA链交联以阻断其转录复制过程，从而诱导癌细胞死亡[9]。如今，基于奥沙利铂的化学疗法被认为是CRC的一线治疗方法，此外，也用于其他癌症的治疗当中，如胃癌和胰腺癌[10-11]。然而，单独或联合使用奥沙利铂治疗中获得性耐药的产生会导致治疗失败，并且几乎所有转移性CRC最终都会产生耐药性，因此，探究提高CRC治疗中肿瘤细胞对奥沙利铂的敏感性具有重要意义。
目前，关于CRC细胞中奥沙利铂抗药性产生的分子机制尚未完全阐明，必须要更好地了解耐药性产生中相关分子机制以开发提高CRC细胞化疗敏感性的有效治疗方法。SDF-1的生物学效应与其触发的趋化反应、细胞增殖、细胞转移以及基质金属蛋白酶和血管生成因子分泌的能力有关[12]。越来越多的研究表明，SDF-1及其受体的相互作用可激发下游信号传导途径，从而在肿瘤的发生发展、肿瘤血管生成和化学抗性中发挥作用[13]。SDF-1/CXCR4相互作用使CXCR4磷酸化，促进钙通量，并直接激活MAPK、PI3K、Wnt和Sonic-Hedgehog信号通路，从而诱导各种类型肿瘤细胞的增殖[14]。此外，SDF-1在膀胱癌、胃癌、肝细胞癌、前列腺癌中均高水平表达[15-16]，由此可见，SDF-1及其受体可能是癌症治疗的潜在靶标。本研究通过体内外研究发现，使用SDF-1抑制剂AMD3100可提高结直肠癌对奥沙利铂的敏感性，从而抑制了肿瘤生长。
肿瘤微环境在癌症生物学的各个方面都具有关键作用，包括生长、转移、血管生成和进展等。趋化因子及其受体最初被确定为炎性疾病的介体，但随着研究的不断深入，人们日益认识到趋化因子及其受体是肿瘤细胞和基质细胞之间的关键沟通桥梁，为肿瘤的生长和转移创造了一个宽松的微环境。因此，一种关键的癌症治疗策略可能打破这种交流通道以破坏肿瘤进展。目前，在肿瘤微环境中靶向SDF-1及其受体的外源性分子与传统化学疗法相结合的研究已引起越来越多的关注。肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是肿瘤微环境中主要成分之一，在肿瘤间质中浸润，参与肿瘤的发生和转移，在肿瘤微环境中靶向调控TAMs已成为癌症免疫疗法的一项新策略，并且可以与传统疗法包括化学疗法和放射疗法结合使用以发挥协同治疗作用，使肿瘤患者获得更好的治疗效果[17]。通常情况下巨噬细胞分为M1型和M2型，其中M1型巨噬细胞能够产生促炎性细胞因子，具有促炎和抗肿瘤特性；
M2型巨噬细胞能够分泌抗炎性细胞因子，发挥抗炎和促肿瘤作用[18-19]。随着肿瘤细胞的不断发展，巨噬细胞逐渐趋向于M2型，促进肿瘤发生和发展[20]。越来越多的证据表明，逆转巨噬细胞从M1型转变为M2型可能会通过抑制细胞增殖与转移、药物依赖和免疫逃逸来阻止癌症的发生和发展[21]。本研究中使用SDF-1抑制剂AMD3100作用TAMs后，M1型巨噬细胞相关标记物iNOS、TNF-α的表达升高，M2型巨噬细胞相关标记物TGF-β、Arg-1的表达则降低，表明SDF-1抑制剂AMD3100调控了TAMs亚型转化。此外，经过SDF-1抑制剂AMD3100作用结直肠癌移植瘤裸鼠后，肿瘤组织中M1亚型巨噬细胞标记物F4/80+CD11c+表达增加，iNOS阳性表达率升高，M2亚型巨噬细胞标记物F4/80+CD206+表达减少，Arg-1阳性表达率下降，这进一步从体内证明了靶向SDF-1调控TAMs亚型转化从而增强了结直肠癌对奥沙利铂的敏感性。
靶向SDF-1能够提高结直肠癌肿瘤细胞对奥沙利铂的敏感性，起到协同抑制肿瘤生长的作用，其机制可能与诱导结直肠癌肿瘤相关巨噬细胞的亚型转化相关。本研究为结直肠癌的免疫治疗提高了一种新思路，为针对SDF-1及其下游信号通路的免疫治疗提供了理论依据。
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