顾英琳 张胜波 李正国
（1.济宁医学院药学院， 山东 济宁272067；
2.济宁市食品药品检验检测中心， 山东 济宁272073）
决明子为豆科植物决明或小决明的干燥成熟种子［1］，始载于《神农本草经》［2］，具有清热明目、润肠通便的功效［3⁃5］。决明子配方颗粒是由具有GMP 资质的制药公司生产的中药汤剂改良产品，其优点在于携带和使用方便［6］，在临床治疗上常用于治疗羞明多泪、目暗不明、目赤涩痛、头痛眩晕、大便秘结等症状［7］，但大多数配方颗粒缺乏统一的质量标准和一致性评价［8⁃10］。配方颗粒与中药材标准水煎剂的等效性尚不清楚。研究显示，决明子中的有效成分主要为蒽醌类化合物［11⁃14］，目前有关决明子中有效成分含量测定的研究多针对橙黄决明素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素等，其中以对橙黄决明素和大黄酚的研究为主［15⁃18］。本研究拟采用HPLC 法对决明子与其配方颗粒中橙黄决明素、大黄酚成分进行目标导向分离。与2020年版《中国药典》中描述的提取工艺相比，本方法操作简单、专属性高，稳定性好，更有利于企业对配方颗粒的质量进行客观评价，同时降低对决明子及其配方颗粒中橙黄决明素、大黄酚含量检测的成本。
1.1 仪器 Nexera LC⁃20ADXR 高效液相色谱系统（日本岛津公司），配置SPD⁃20A 紫外可见光检测器、LC⁃20AD多溶剂输送系统、CTO⁃20AC 柱温箱、LabSolutions 数据处理工作站；
BT25S 型十万分之一电子天平、CP224S 型万分之一电子天平（德国Sartorius 公司）；
KQ⁃500VDE 型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2 试剂与药物 大黄酚（批号110796⁃201922，纯度99.4%）、橙黄决明素（批号111900⁃202006，纯度99.0%）对照品（中国食品药品检定研究院）。决明子（批号181201，产地河南洛阳，亳州市圣海中药饮片有限公司），经专家鉴定为正品。炒决明子配方颗粒（批号9115612，2.0 g／袋，相当于原药材10 g，广东一方制药有限公司）。0.45 μm 醋酸纤维素膜过滤器（大连精研分析仪器有限公司）。甲醇、乙腈均为色谱纯（美国Thermo Fisher 公司）；
异丙醇为色谱纯，无水乙醇、乙酸乙酯、磷酸等均为分析纯（天津市四友精细化学品有限公司）；
水为超纯水（1815 元素型摩尔超纯水系统制备）。
2.1 溶液制备
2.1.1 对照品溶液 精密称取橙黄决明素、大黄酚对照品各10.00 mg，置于50 mL 量瓶中，加入甲醇混匀、定容，超声处理10 min，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得（质量浓度为200 μg／mL）。
2.1.2 供试品溶液 决明子粉碎后过120 目筛，精密称取粉末和配方颗粒各1 g，分别置于250 mL 圆底烧瓶中，各加入80 mL 甲醇水浴加热，回流时间为100 min，趁热过滤，用甲醇洗涤残渣3次，合并滤液，再水浴加热，回收甲醇，残渣中加入20 mL 蒸馏水进行溶解，超声处理10 min，加入20 mL 无水乙醇⁃乙酸乙酯（1∶1）混合液萃取，萃取层用水浴锅进行加热，回收溶剂，残渣用甲醇溶解，分3 次移至25 mL 量瓶中，加入甲醇混匀、定容，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。
2.2 色谱条件 Waters Atlantic T3 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；
流动相90% 乙腈与10% 异丙醇混合液⁃0.1%磷酸（70∶30）；
体积流量1.0 mL／min；
柱温35 ℃；
检测波长284 nm；
进样量10 μL。色谱图见图1。
图1 各成分HPLC 色谱图
2.3 方法学考察
2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液0.01、0.03、0.10、0.40、2.00、5.00 mL，分别置于6个10 mL 量瓶中，甲醇稀释摇匀，定容，0.45 μm 微孔滤膜过滤，制得质量浓度 为0.2、0.6、2.0、8.0、40、100 μg／mL的对照品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程分别为橙黄决明素Y＝8.41×103X＋13.26（r＝0.999 9）、大黄酚Y＝9.22×103X＋4.92（r＝0.999 8），分别在0.60～100.00 μg／mL 范围内线性关系良好。
2.3.2 日内精密度试验 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液0.6、8.0、70 μg／mL，同一天在“2.2”项色谱条件下进样测定6次，测得橙黄决明素峰面积RSD 分别为0.67%、1.02%、1.93%，大黄酚峰面积 RSD 分别为1.32%、0.85%、1.76%，表明该方法日内精密度良好。
2.3.3 日间精密度试验 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液0.6、8.0、70 μg／mL，在“2.2”项色谱条件下进样测定6次，连续3 d，测得橙黄决明素峰面积RSD 分别为0.98%、1.61%、2.60%；
大黄酚峰面积RSD 分别为1.46%、1.05%、2.23%，表明该方法日间精密度良好。
2.3.4 稳定性试验 精密吸取“2.1.1”项下对照品溶液及“2.1.2”项下供试品溶液适量，于0、1、2、8、12、24 h 在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得对照品溶液中橙黄决明素、大黄酚峰面积RSD 分别为0.12%、0.21%，决明子供试品溶液中橙黄决明素、大黄酚峰面积RSD 分别为0.34%、0.25%，决明子配方颗粒供试品溶液中橙黄决明素、大黄酚峰面积RSD 分别为0.27%、0.24%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。
2.3.5 重复性试验 称取同一批决明子和决明子配方颗粒各6份，按“2.1.2”项下方法制备决明子和决明子配方颗粒供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定6次，测得决明子中橙黄决明素含量RSD 为1.26%，大黄酚含量RSD 为0.9%；
决明子配方颗粒中橙黄决明素含量RSD 为0.82%，大黄酚含量RSD 为0.66%，表明该方法重复性良好。
2.3.6 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的同一批决明子和决明子配方颗粒各6份，每份0.1 g，分别精密加入10 mL 对照品溶液（含橙黄决明素、大黄酚各10.00 μg／mL），按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，计算加样回收率。结果，决明子中橙黄决明素、大黄酚的平均加样回收率（RSD）分别为94.20%（1.59%）、98.71%（1.01%），决明子配方颗粒中橙黄决明素、大黄酚的平均加样回收率（RSD）分别为96.42%（1.50%）、102.15%（1.03%）。
2.4 含量测定 取决明子（批号181201）及其配方颗粒（批号9115612）各3份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表1。
表1 各成分含量测定结果（%，n＝3）
研究表明，决明子药材与配方颗粒在临床上常用于治疗羞明多泪、目暗不明、目赤涩痛、头痛眩晕、大便秘结等症状［2⁃4］。随着中药在全世界范围的推广，定量准确已经不能满足于对中药质量的控制要求，而建立多指标成分同步分析的模式已经成为关注的重点。决明子主要是通过水解蒽醌苷进行质量控制，包括其水解产物大黄酚及橙黄决明素。本研究建立测定决明子药材与配方颗粒的HPLC 特征图谱，对两者中橙黄决明素、大黄酚的含量进行测定，建立质量标准，鉴别市场上决明子药材与配方颗粒的正伪与优劣。
本研究通过对提取方式（超声提取法、热回流提取法、连续回流提取法）的考察发现，热回流提取法对橙黄决明素和大黄酚同时提取的效果相对较好；
在此基础上进一步考察甲醇、70% 甲醇、50% 甲醇对提取结果的影响，结果表明甲醇提取物色谱图杂质干扰较少，且提取率较高，故选择甲醇热回流提取法；
对提取时间（30、60、100、150 min）进行考察，确定提取时间为100 min时，有效成分已提取完全。此外，本研究考察不同流动相的分离效果，与传统的乙腈⁃水、甲醇⁃水、乙腈⁃0.1%磷酸这3 个不同流动相系统的分离效果相比较，乙腈与异丙醇（90∶10）混合液⁃0.1%磷酸等度洗脱对所测有效成分达到基线分离，效果较好。
相较于以往研究方法，本方法操作简单，采用等度洗脱，专属性高，稳定性好，降低检验成本，通过对决明子与配方颗粒中橙黄决明素、大黄酚的含量测定，对质量进行客观评价，鉴别市场上决明子与配方颗粒的正伪与优劣，为保证药材质量提供科学依据。
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