梁 义，李 健，白 波，孙成林，孙宏旭
结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是全球第3大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第2大原因[1-2]。在许多发展中国家，CRC的发病率和死亡率仍在迅速上升，预计到2030年，CRC的公共卫生负担将增加60%，新确诊的病例将超过220万，死亡人数将达到110万人[3]。随着早期筛查的实施和规范化治疗的进展，CRC患者的预后明显改善，早期患者5年生存率接近90%，然而，由于缺乏明显的早期症状以及早期发现和筛查的局限性，大多数CRC患者在晚期才被诊断出来，这些患者的预后仍很差，特别是有晚期疾病和远处转移的患者，其5年生存率仅为13.1%[4]。开发CRC治疗的新药物仍是必要的。桔梗是东亚各国广泛应用的药用植物，对肝细胞癌、胃癌、前列腺癌、小细胞肺癌和肾细胞癌等多种癌症具有潜在的治疗作用[5]。远志皂苷D(Polygalacin D,PGD)是桔梗中的一种三萜皂苷，是桔梗的主要化学成分之一[6]。目前尚无其在结直肠癌治疗中发挥作用的相关报道。本研究探究了PGD对CRC细胞体外增殖、迁移和侵袭及体内肿瘤生长的作用，并分析其机制，为CRC治疗药物的开发提供理论依据。
1.1 主要试剂和仪器 远志皂苷D(美国MCE公司)；
DMEM高糖培养基、胎牛血清和Lipofectamine 3000转染试剂(美国Thermo公司)；
PCDNA3.1 β-catenin过表达质粒(上海吉玛制药技术有限公司)；
RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、ECL发光试剂盒和CCK-8增殖检测试剂盒(上海碧云天生物科技公司)；
p-GSK3β、β-catenin、cyclinD1、c-Myc、GAPDH和Ki-67抗体(美国Abcam公司)；
山羊抗兔二抗(美国Abcam公司)；
酶标仪(美国Thermo公司)；
光学显微镜(日本奥林巴斯公司)；
荧光显微镜(日本尼康公司)；
化学发光成像系统(上海天能生物公司)；
低温高速离心机(德国Eppendorf公司)。
1.2 细胞培养及转染 结直肠癌SW620细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基在37 ℃含5%二氧化碳的恒温培养箱中培养。细胞转染严格按照Lipofectamine 3000转染试剂说明书进行。
1.3 CCK-8检测不同浓度PGD对结直肠癌细胞增殖的影响 将结直肠癌SW620细胞均匀铺板于96孔板中，培养过夜后，各孔分别加入0、1.25、2.5、5、10、15、20、25、30、40、50、60 μM PGD处理细胞，继续培养24 h，弃培养基，加入110 μl CCK-8检测试剂(含10 μl CCK-8)，37 ℃孵育1 h，酶标仪检测450 nm吸光度值。
1.4 Transwell检测不同浓度PGD对结直肠癌细胞迁移和侵袭的影响 将结直肠癌SW620细胞分别加入基质胶不包被(迁移实验)或包被(侵袭实验)的Transwell小室上室中，细胞分为4组：对照组、PGD低剂量组(PGD-L组)、PGD中剂量组(PGD-M组)和PGD高剂量组(PGD-H组)，分别加入0、15、25、40 μM PGD，上室加入无血清培养基，下室加入含20%胎牛血清的培养基，继续培养48 h后，甲醛固定，1 %结晶紫染色30 min，光学显微镜下观察并拍照。
1.5 Western blot 将结直肠癌SW620细胞分为4组：对照组、PGD低剂量组(PGD-L组)、PGD中剂量组(PGD-M组)和PGD高剂量组(PGD-H组)，分别加入0、15、25、40 μM PGD，继续培养24 h后，收集细胞，加入RIPA裂解液，冰上孵育30 min，超声破碎仪冰上破碎3次，4 ℃ 12 000转/min离心20 min，BCA法检测蛋白浓度，根据蛋白浓度配置蛋白样品，沸水煮样5 min使蛋白充分变性，将变性的蛋白样品加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶上样孔中进行电泳，将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，p-GSK3β、β-catenin、cyclinD1、c-Myc和GAPDH抗体4 ℃孵育过夜，PBST洗膜3次，山羊抗兔二抗室温孵育1 h，PBST洗膜3次，ECL法发光，Image J计算条带灰度值。
1.6 裸鼠成瘤 将结直肠癌SW620细胞皮下注射BALB/c nude裸鼠，将裸鼠随机分为对照组和PGD组，PGD组瘤内注射PGD(10 mg/kg)，对照组注射等量生理盐水，从皮下注射细胞后第3天开始，每隔3 d注射1次，于皮下注射细胞后第22天，脱颈椎法处死裸鼠，取肿瘤组织，测量肿瘤体积及瘤重。通过免疫荧光检测肿瘤组织Ki-67表达，具体步骤为将肿瘤组织置于4%多聚甲醛中，室温固定6 h，转移至20%蔗糖中至组织沉底，包埋并冰冻组织块，恒温冰冻切片机将组织切成厚8 μm的冰冻切片，室温放置30 min，PBS洗涤3次，每次5 min，Ki-67一抗4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次，每次5 min，荧光二抗室温避光孵育1 h，PBS洗涤3次，每次5 min，DAPI染色液室温孵育30 min，PBS洗涤3次，每次5 min，抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察并拍照。取移植瘤组织并剪碎，加入RIPA裂解液，组织匀浆机冰上匀浆3次，冰上孵育30 min，通过Western blot检测肿瘤组织p-GSK3β、β-catenin、cyclinD1、c-Myc和GAPDH蛋白表达，后续步骤与上述Western blot步骤一致。
1.7 CCK-8检测过表达β-catenin对PGD处理的结直肠癌细胞增殖的影响 将结直肠癌SW620细胞均匀铺板于96孔板中，细胞分为3组：对照组、PGD组、PGD+β-catenin组。PGD组和PGD+β-catenin组加入40 μM PGD处理24 h，PGD+β-catenin组在PGD处理前24 h严格按照Lipofectamine 3000转染试剂说明书转染β-catenin过表达质粒，PGD处理后，弃培养基，加入110 μl CCK-8检测试剂(含10 μl CCK-8)，37 ℃孵育1 h，酶标仪检测450 nm吸光度值。
1.8 Transwell检测过表达β-catenin对PGD处理的结直肠癌细胞迁移和侵袭的影响 将结直肠癌SW620细胞分别加入基质胶不包被(迁移实验)或包被(侵袭实验)的Transwell小室上室中，细胞分为3组：对照组、PGD组、PGD+β-catenin组，PGD组和PGD+β-catenin组加入40 μM PGD处理24 h，PGD+β-catenin组在加入上室前严格按照Lipofectamine 3000转染试剂说明书转染β-catenin过表达质粒，上室加入无血清培养基，下室加入含20%胎牛血清的培养基，继续培养48 h后，甲醛固定，1 %结晶紫染色30 min，光学显微镜下观察并拍照。
2.1 PGD抑制结直肠癌细胞增殖 CCK-8结果显示，与0 μM相比，5 μM、10 μM、15 μM、20 μM、25 μM、30 μM、40 μM、50 μM和60 μM PGD处理的SW620细胞增殖活性显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；
PGD处理SW620细胞的IC50值为25.11 μM。见图1。
图1 不同浓度PGD对CRC细胞活性增殖的影响(n=3)注：PGD：远志皂苷D；
CRC：结直肠癌。*与 0 μM组比较，P<0.05
2.2 PGD抑制结直肠癌细胞迁移和侵袭 Transwell迁移实验结果显示，与对照组相比，PGD-L组、PGD-M组和PGD-H组SW620细胞穿膜细胞数显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；
Transwell侵袭实验结果显示，与对照组相比，PGD-L组、PGD-M组和PGD-H组SW620细胞穿膜细胞数显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。
2.3 PGD抑制结直肠癌细胞Wnt/β-catenin信号通路 Western blot结果显示，与对照组相比，PGD-L组、PGD-M组和PGD-H组SW620细胞p-GSK3β(S9)、β-catenin、cyclinD1和 c-Myc蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。
2.4 PGD抑制结直肠癌细胞移植瘤肿瘤生长 裸鼠成瘤实验结果显示，与对照组相比，PGD组SW620细胞移植瘤变小，肿瘤体积和瘤重显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。
2.5 PGD抑制结直肠癌细胞移植瘤Ki-67表达 免疫荧光结果显示，与对照组相比，PGD组SW620细胞移植瘤Ki-67表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。
2.6 PGD抑制结直肠癌细胞移植瘤Wnt/β-catenin信号通路 Western blot结果显示，与对照组相比，PGD组SW620细胞移植瘤p-GSK3β(S9)、β-catenin、cyclinD1和 c-Myc蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图6。
图2 不同浓度PGD对CRC细胞迁移和侵袭的影响(n=3)注：PGD：远志皂苷D；
CRC：结直肠癌。*与对照组比较，P<0.05
图3 不同浓度PGD对CRC细胞Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达的影响(n=3)注：PGD：远志皂苷D；
CRC：结直肠癌。*与对照组比较，P<0.05
图4 PGD对CRC细胞移植瘤肿瘤生长的影响(n=3)注：PGD：远志皂苷D；
CRC结直肠癌。*与对照组比较，P<0.05
图5 PGD对CRC细胞移植瘤Ki-67表达的影响(n=3)注：PGD：远志皂苷D；
CRC：结直肠癌。*与对照组比较，P<0.05
图6 PGD对CRC细胞移植瘤Wnt/β-catenin信号通路的影响(n=3)注：PGD：远志皂苷D；
CRC结直肠癌。*与对照组比较，P<0.05
2.7 PGD通过Wnt/β-catenin信号通路抑制结直肠癌细胞增殖 CCK-8结果显示，与对照组相比，PGD组SW620细胞增殖活性显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；
与PGD组相比，PGD+β-catenin组SW620细胞增殖活性显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图7。
图7 PGD通过Wnt/β-catenin信号通路抑制CRC细胞增殖(n=3)注：PGD：远志皂苷D；
CRC结直肠癌。*与对照组比较，P<0.05;#与PGD组比较，P<0.05
2.8 PGD通过Wnt/β-catenin信号通路抑制结直肠癌细胞迁移和侵袭 Transwell迁移实验结果显示，与对照组相比，PGD组SW620细胞穿膜细胞数显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；
与PGD组相比，PGD+β-catenin组SW620细胞穿膜细胞数显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；
Transwell侵袭实验结果显示，与对照组相比，PGD组SW620细胞穿膜细胞数显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；
与PGD组相比，PGD+β-catenin组SW620细胞穿膜细胞数显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图8。
CRC是一种常见的癌症，约占全球所有癌症的10%，目前是世界上第三大常见的男性癌症和第二大常见的女性癌症[7]。CRC通常起源于肠壁并涉及结肠、直肠和阑尾[8]。手术切除、化疗和放疗是目前CRC患者的主要治疗策略，其中早期癌症患者优先考虑手术切除，而放化疗则是疾病晚期的治疗方式[9]。转移是CRC患者高死亡率的主要原因[10]。开发抑制CRC转移的相关治疗药物是必要的。桔梗是桔梗科的一种植物，其干根在中药中用于调节肺经，具有润肺、化痰、排脓的作用，是治疗咽喉痛、化脓性痈感染呕吐、胸胁痛等证候的主要药物[11]。PGD是一种三萜皂苷，是桔梗的主要化学成分之一[12]。Xiao等[13]的研究结果显示，PGD显著降低了食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)细胞增殖，并诱导G2/M细胞周期阻滞、凋亡及自噬，此外，其还抑制ESCC细胞的迁移和侵袭[13]。Seo等[6]的研究发现，PGD诱导非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞凋亡和G0/G1期阻滞。本研究结果显示，PGD在体外剂量依赖性地抑制CRC细胞增殖、迁移和侵袭，并在体内抑制CRC细胞肿瘤生长，表明PGD在CRC中发挥抗癌作用。
图8 PGD通过Wnt/β-catenin信号通路抑制CRC细胞迁移和侵袭(n=3)注：PGD：远志皂苷D；
CRC结直肠癌。*与对照组比较，P<0.05;#与PGD组比较，P<0.05
Wnt/β-catenin信号通路是一个保守的信号转轴，参与增殖、分化、凋亡、迁移、侵袭和组织稳态等多种生理过程，其失调促进一些实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤的发生和发展[14]。Wnt/β-catenin信号通路通过调节β-catenin的水平来调节关键发育基因的表达，β-catenin在转录调节和染色质相互作用中作为细胞内信号转换器，糖原合成酶激酶(Glycogen synthase kinase,GSK)-3β和酪蛋白激酶1α(Casein kinase 1α,CK1α)介导β-catenin的磷酸化，促进其泛素化和随后的蛋白酶体降解，GSK-3β磷酸化促进β-catenin在细胞核中的积累和核异位，从而促进其下游靶基因表达[15]。研究表明，PGD可抑制NSCLC中GSK-3β磷酸化[6]。本研究结果显示，PGD抑制CRC细胞及移植瘤中p-GSK3β、β-catenin、cyclinD1和 c-Myc蛋白表达，此外，过表达β-catenin促进PGD处理的CRC细胞增殖、迁移和侵袭。
综上所述，本研究发现，PGD在体外抑制CRC细胞增殖、迁移和侵袭，且在体内抑制CRC细胞移植瘤肿瘤生长，这可能与其抑制GSK-3β磷酸化,从而抑制Wnt/β-catenin信号通路激活有关。因此，PGD有望成为CRC治疗的有效药物。
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