刘 兰，李 鹏，王 通，黄筱萍
(江西省科学院微生物研究所，330096 ，南昌)
衣康酸学名为甲叉琥珀酸、亚甲基丁二酸，是世界上第五大有机酸，并被美国能源部选为 12 种可从糖平台技术生物制备的最具开发和应用潜力的生物精炼高附加值产品之一[1-2]。衣康酸生产方法主要有化学合成、柠檬酸分解法及微生物发酵法，而其中的微生物发酵法生产衣康酸基本以淀粉糖为发酵原料，占用了大量的粮食资源，给人类造成了粮食危机。Mass[3]指出利用木质纤维素生产有机酸等大宗化学品是未来的主要发展方向。我国每年产生大量农业秸秆，农业秸杆中的纤维素和半纤维素，水解产物主要是葡萄糖和木糖，木糖在水解液中含量仅次于葡萄糖，最多可达31%[4-6]，可用于发酵生产衣康酸。目前报道的研究中，利用葡萄糖发酵生产衣康酸已经达到较高水平[7-11]，而有关木糖发酵衣康酸的报道较少。Saha[12]报道了部分土曲霉菌种可利用木糖产衣康酸，产酸率30 g/L左右。2016年，孙婷[13]研究土曲霉菌种利用小麦麸水解糖(葡萄糖和木糖)发酵衣康酸达49.65±0.43 g/L。杨静[14]开展了玉米芯和麸皮进行衣康酸发酵研究，产率均不高。因此，选育高效利用木糖的适宜菌株是实现农业秸秆生产衣康酸的前提基础，对利用农业秸秆纤维质原料发酵生产衣康酸有着重要的意义。
本研究利用前期工作中筛选到的1株可利用木糖产衣康酸的土曲霉菌株(Aspergillusterreus)ASP-046为出发菌株，采用紫外诱变方法[15]，筛选了高效利用木糖产衣康酸的发酵菌株。然后，通过Plackett-Burman试验和Box-Behnken 响应面试验设计法[16-17]优化土曲霉发酵培养条件，探索初始pH、发酵温度、接种量、装液量、摇床转速、发酵时间多因素间的相互作用，确定衣康酸发酵最佳培养条件，提高衣康酸产量，为利用秸秆糖产衣康酸提供优良菌株及技术支持。
1.1 材料与试剂
1.1.1 试验菌种 土曲霉菌种AspergillusterreusASP-046，本实验室筛选保藏。
1.1.2 试剂 衣康酸标准品(纯度99%)：美国SIGMA公司；
木糖：济南圣泉唐和生物科技有限公司，纯度99.5%；
玉米浆：CAS 66071-94-1阿拉丁；
其他试剂均来自生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.1.3 培养基 斜面培养基(g/L)：木糖20.0，氯化钠20.0，玉米浆4.0，琼脂粉20.0，定容至1 L，pH 6.8。
种子培养基(g/L)：木糖50.0，硝酸铵(NH4NO3)5.0，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)2.0，玉米浆1.2，定容至1 L， pH 3.0。
发酵培养基(g/L)：木糖110.0，硝酸铵(NH4NO3)4.0，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.0，玉米浆0.8，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.06，五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.06，定容至1 L， pH 3.0。
指示剂培养基(g/L)：木糖80.0，硝酸铵(NH4NO3)4.0，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)1.0，玉米浆0.8，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.06，琼脂粉20.0，0.2%溴甲酚绿溶液(称取0.5g溴甲酚绿溶于250 mL20%的乙醇溶液中即得)50 mL/L，pH 6.8。
1.2 仪器与设备
美国Waters公司e2695 Alliance高效液相色谱仪(配置2414示差检测器)；
德国赛多利斯Sartorius practum 224-ICN分析天平；
湖南湘仪高速离心机H1650-W；
上海智城恒温培养振荡器ZWY-2102C；
上海博迅生化培养箱SPX-250B-Z；
北京赛百奥科技有限公司UV-Ⅷ紫外诱变箱；
TOSOH Tskgel OApak-P+OApak-A(300 mm×7.8 mm，5 μm)色谱柱。
1.3 方法
1.3.1 检测方法 发酵液于10 000 r/min离心10 min；
取上清液，稀释，用0.22 μm聚醚水性滤膜过滤，采用Waters e2695 Alliance高效液相色谱分离单元和Waters 2414示差检测器进行分析。
色谱条件：色谱柱TOSOH Tskgel OApak-P+OApak-A(300 mm×7.8 mm、5 μm)；
柱温：30℃；
进样量：10 μL；
流速：1.0 mL/min；
流动相：0.75 mmol/L H2SO4；
测定发酵液中衣康酸和残糖含量。
1.3.2 诱变方法 单孢子悬液的制备：用无菌水洗脱培养5 d的斜面孢子，接入种子培养基中，30℃振荡培养至孢子刚萌芽(约6 h)，移入装有玻璃珠及无菌水的三角瓶中，振荡打碎孢子团块，然后用无菌脱脂棉过滤，用血球计数板计数，调整孢子数约1×106个/mL。
紫外诱变：吸取单孢子悬液5 mL放置于磁力搅拌上的培养皿中，254 nm紫外灯下，距离20 cm，分别照射0 s、40 s、80 s、160 s、200 s和240 s，边搅拌边照射，完毕后立即在红外线灯光下，将孢子液稀释涂平板(指示剂培养基)，用黑布包好，放置30 ℃恒温培养3—5 d，计算致死率。选取致死率70%～80%的紫外诱变剂量，反复诱变，挑选生长快、变色圈与菌落直径比大的单菌落，接入斜面培养。
摇瓶筛选：突变菌株经斜面30 ℃恒温培养4—5 d后，用无菌水洗脱斜面孢子(孢子数约×108)，接入到种子培养基中，于30 ℃，170 r/min振荡培养48 h。按8%接种量接种于摇瓶发酵培养基中(250 mL三角瓶，装液量40 mL)，32 ℃，220 r/min振荡培养6 d，发酵结束后测定衣康酸和残糖。根据产酸量及残糖，计算糖酸转化率，筛选出优良的突变株。糖酸转化率按式(1)计算：
(1)
突变株稳定性考察：选取产酸高的突变株进行传代稳定性试验，连续传代6次，测定产酸能力。
1.3.3 不同碳源利用考察试验 挑选诱变后产酸高且稳定性好的土曲霉菌株ASP-M-87，分别加入浓度为110 g/L的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、果糖、乳糖，其他成分不变，考察不同碳源对衣康酸产量的影响。另外，考察了葡萄糖及木糖不同配比起始浓度对衣康酸产量的影响。
1.3.4 单因素试验 以土曲霉菌株ASP-M-87，进行发酵培养条件单因素试验。选取了土曲霉发酵过程中培养基初始pH、接种量、培养温度、装液量、摇床转速5个单因素，分别设置不同梯度，通过测定衣康酸含量，确定各因素最适水平。
1.3.5 Plackett-Burman(PB)试验 在单因素试验的基础上，采用Design-Expert 8.0.6软件的Plackett-Burman试验设计从培养基初始pH、装液量、培养温度、接种量、摇床转速以及培养时间6个因素中筛选对衣康酸产量影响显著的因素。每组3个平行试验，培养结束后检测衣康酸含量。PB试验因素及水平表见表1。
1.3.6 最陡爬坡试验 根据Plackett-Burman试验结果，对影响显著的各因素效应值的大小确定变化的步长，正效应取高水平，负效应取低水平。
表1 Plackett-Burman设计因素水平表
按一定的梯度增加或者减少各因素的水平值，检测发酵液中衣康酸含量的变化，含量最高组的水平值即为响应面分析的中心组。
1.3.7 Box-Behnken(BB)响应面试验 以最陡爬坡试验筛选出的含量最高组的水平值作为中心点，采用Box-Behnken中心组合试验设计，以Plackett-Burman试验确定的3个显著因素为自变量，衣康酸含量为响应值，进行3因素3水平试验，运用Design Expert 8.0.6软件对数据进行二次回归拟合，得到响应值拟合方程，并对方程进行方差分析和可靠性分析，得到最大响应值的各因素的最佳水平值，得出最佳的发酵培养条件。响应面试验因素及水平表见表2。
表2 Box-Behnken 设计因素水平表
1.3.8 验证试验 用响应面试验得出的最佳培养条件进行3次平行验证试验，取平均值，以验证响应面结果是否可靠，从而确定最优发酵培养条件。
2.1 紫外线诱变
2.1.1 紫外诱变时间的确定 将照射0 s、40 s、80 s、160 s、200 s和240 s后的单孢子悬液，涂布木糖为唯一碳源的平板，30 ℃培养3—5 d 后计数菌落，计算各个诱变时间的致死率，结果见图1。由图1可知，照射时间160 s后，土曲霉ASP-046的致死率逐渐增大，均大于70%。研究表明：紫外诱变致死率70%～80%的突变率最高[15]，因此选取紫外诱变时间为160 s。
图1 紫外诱变致死率曲线
2.1.2 紫外诱变结果 土曲霉菌株ASP-046孢子悬液紫外诱变160 s，涂布指示剂培养基，30 ℃培养5 d，从中选出了100株变色圈与菌落直径比较大的菌株，进行摇瓶初筛和复筛试验，其中10株的产酸量明显提高，结果见表3。
表3 紫外诱变的摇瓶发酵结果
从表3结果看出，菌株ASP-M-67、ASP-M-87复筛产酸后产量仍然较高，分别为42.54 g/L和43.28 g/L。较出发菌株(20.34 g/L)提高了109.14%和112.78%。
2.1.3 突变菌株ASP-M-87稳定性考察 对突变土曲霉菌株ASP-M-87连续培养6代，进行摇瓶发酵试验，产酸量结果分别为：43.28 g/L、43.12 g/L、43.09 g/L、43.01 g/L、42.98 g/L、42.89 g/L，产酸量几乎无变化 ，说明土曲霉菌株ASP-M-87有较好的稳定性。
2.2 不同碳源利用考察试验
分别以葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、果糖、乳糖以及葡萄糖和木糖不同比例为碳源，考察了诱变菌株ASP-M-87对不同碳源的利用情况。表4结果显示：该菌株不利用果糖、乳糖；
能转化葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和蔗糖。在糖浓度110 g/L的情况下，葡萄糖产酸最高、其次蔗糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖。表5结果显示：不同比例的葡萄糖及木糖为碳源混合发酵时，葡萄糖比例高，产酸高，而且该菌株先转化葡萄糖，再转化木糖。据文献报道[18]：木糖的跨膜运输存在两种不同的运输系统，低亲和力运输系统为木糖和葡萄糖共享，不被葡萄糖抑制；
高亲和力则通过葡萄糖运输因子HXT4、HXT5、HXT7和Gal2介导进行的，葡萄糖的存在，可能影响到了发酵菌株对木糖的优先利用。
2.3 单因素试验结果
以木糖为碳源，进行了不同因素对衣康酸产量影响试验，结果见表6。发酵过程中培养基的pH值是一项重要的发酵参数，对菌体的生长和产物的合成有很大的影响，pH值的变化会引起酶活力的改变，影响菌体对基质的利用速度和细胞结构，以致于影响菌体的生长和产物的合成，因此确定发酵过程的最适pH值是保证或提高产量的重要环节。从表6中可知，pH为1.7时，几乎不产酸，pH为2.0～5.0，产酸几乎相当；
在发酵过程中温度也是保证衣康酸发酵正常进行的重要条件之一，因为温度是保证酶活性的重要条件，并可以影响基质和氧在发酵液中溶解和传递速率。实验结果表明，ASP-M-87的适宜发酵温度为35 ℃，超过39 ℃，几乎不产酸。接种量以8%～10%的比例较好，接种量太低时，由于长菌时间过长，延长了发酵周期，后期菌种活力下降，产酸率下降；
高于10%时，接入的老菌丝比例高，菌种活力低，发酵产酸率降低。土曲霉属于好氧微生物，溶解氧是衣康酸发酵非常重要的一个影响因素，适当的溶解氧维持其呼吸和代谢产物的合成，氧的不足会造成代谢异常，产量下降。当装液量20～40 mL/250mL三角瓶时，产酸量相当；
当摇床转速从100 r/min增加至300 r/min时，产酸量逐步增加后稍下降，显示250 r/min左右时较佳。
表4 不同碳源产衣康酸试验结果
表5 葡萄糖与木糖不同比例产衣康酸结果
表6 不同因素对衣康酸产量的影响
2.4 Plackett-Burman试验显著因子筛选
Plackett-Burman试验结果见表7，利用Design-Expert 8.0.6软件对表7的结果进行回归方差分析，得到各因素的偏回归系数和影响显著性见表8。从表8可知，培养温度、摇床转速对衣康酸产量影响极显著(P均小于0.01)，其次影响为接种量，因此确定培养温度、摇床转速以及接种量作为下一步进行爬坡试验的关键因素。其他因素的取值可以根据各因素效应的正负和大小，正效应的因素取较高值，负效应的因素取较低值。
2.5 最陡爬坡试验
根据Plackett-Burman试验结果及显著因子分析结果，选取了培养温度、摇床转速、接种量进行最陡爬坡试验，具体试验设计及结果见表9。
表7 Plackett-Burman试验设计及结果
表8 Plackett-Burman试验设计影响因素显著性及效应分析
从表9可知，第3组发酵培养条件对应的衣康酸产量最高，因此以培养温度35 ℃、摇床转速260 r/min、接种量10%v/v 作为中心点，进行下一步响应面试验分析。
表9 最陡爬坡试验设计及结果
2.6 Box-Behnken试验优化发酵培养条件
以衣康酸浓度(Y)为响应值，选取培养温度(A)、摇床转速(B)以及接种量(C)3个因素进行了三因素三水平的Box-Behnken试验，试验设计及结果见表10。
利用Design Expert 8.0.6软件对表10试验结果进行二次回归分析，得二次多项式回归模型方程：Y=60.48+6.64A-2.27B+0.95C-0.96AB-6.58AC-0.11BC-15.65A2-3.79B2-7.49C2。
表10 Box-Behnken试验设计及结果
方差分析中，F值反映各因素对响应值衣康酸浓度的影响强度，数值越大，影响越大， A>B>C，即温度>摇床转速 >接种量。各因素交互作用响应面曲线图见图2、图3以及图4。通过Design Expert 8.0.6软件分析得到最佳发酵培养条件：培养温度35.69 ℃、摇床转速246.95 r/min、接种量9.83%v/v，衣康酸浓度的理论预测值为61.599 g/L。
表11 回归模型方差分析
图2 温度和摇床转速的交互影响衣康酸产量的响应面图
图3 温度和接种量的交互影响衣康酸产量的响应面图
2.7 最佳摇瓶发酵培养条件验证
在预测的最佳发酵培养条件的基础上，考虑到实际操作简便的需要，将该条件修正为：培养温度36 ℃、摇床转速247 r/min、接种量为9.8%，在此工艺条件下进行3次平行验证试验，结果平均值为61.21 g/L，预测值与实测值较相近。这说明二次多项式数学模型进行优化符合设计目标，试验设计与数学模型具有可靠性和准确性。
图4 摇床转速和接种量的交互影响衣康酸产量的响应面图
1)以土曲霉(Aspergillusterreus)ASP-56为出发菌株，采用紫外诱变，选育出了较出发菌株(20.34 g/L)显著提高的菌株，编号为ASP-M-87，该菌株以木糖为碳源，产酸量达43.28 g/L，比出发菌株提高了 112.78%。菌株连续传代6次，遗传稳定性良好，且利用碳源广谱，可利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖以及甘露糖等秸秆糖。该菌株的获得可为进一步利用秸秆糖产衣康酸研究提供菌种资源。
2)在单因素试验的基础上，采用Plackett-Burman试验设计、最陡爬坡试验和Box-Behnken 响应面法优化土曲霉ASP-M-87摇瓶发酵培养条件，优化后的培养条件为：pH2.5、温度36 ℃、转速247 r/min、接种量9.8%(V/V)、装液量30 mL/250mL三角瓶、发酵时间144 h，衣康酸产量达61.21 g/L，木糖转化率达56.89%，比优化前(43.28 g/L)提高了41.43%。此研究结果可为衣康酸发酵工艺提供技术支持。
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