马楚楚，陈帅君，赵宝顶，唐伦霞，童应凯，边嘉宾
（天津农学院 农学与资源环境学院，天津 300392）
硒元素是1817年由ALLAN等[1]首次发现，在之后的几十年里，硒被认为是一种有毒的重金属物质，高剂量的硒对生物体有较大的毒性和致癌性[2]。但在1949年，CLAYTON等[3]研究发现，摄入适量的硒能够减少肿瘤的发生率。1957年，SCHWARZ等[4]通过大鼠试验证明在食物中加入适量的硒能够阻止肝脏坏死。1973年，TURNER等[5]证实硒元素是组成甘氨酸还原酶系统的必需元素。1976年，对该酶硒蛋白组分的化学特征进行研究，证实了有机硒组分为硒代半胱氨酸[6]。
缺硒会引发许多疾病，如抑郁症、心血管疾病、肿瘤、甲状腺功能紊乱、病毒性疾病（如流行性感冒，HIV，埃博拉），精子活性低等[7-9]。补充适量的硒可有效预防此类疾病的发生。1988年，我国把硒元素列为食物中必需的营养元素之一[10]。当今富硒产品主要有富硒植物、富硒鸡蛋、富硒牛奶和富硒酵母，其中最常见的市售硒源是富硒酵母[11]。
产朊假丝酵母（Candida utilis）可以产生大量单细胞蛋白，作为美国食品药品监督管理局评价食品添加剂安全性指标（Generally regarded as safe，GRAS）微生物，具有十分广阔的应用前景[12]。本研究以产朊假丝酵母为出发菌株，向酵母培养液中加入一定量的Na2SeO3，通过酵母的生物转化作用，把无机硒转变为有机硒[13]，以获得富硒产朊假丝酵母，将其制备成饲料添加剂饲喂家畜家禽，从而获得富硒农产品。
1.1 试验材料
1.1.1 菌种
产朊假丝酵母（C. utilis），保藏于天津农学院生物技术系微生物菌种保藏中心。
1.1.2 培养基
斜面培养基：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，酵母膏 10.0 g/L，琼脂20.0 g/L，pH 6.0。
种子培养基：葡萄糖 20.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，酵母膏 10.0 g/L，pH 6.0。
发酵培养基：葡萄糖30.0 g/L，硫酸铵8.0 g/L，磷酸二氢钾3.0 g/L，硫酸镁0.25 g/L，pH 6.0。
补料培养基：葡萄糖150 g/L，硫酸铵18 g/L，磷酸二氢钾6.75 g/L，硫酸镁1.125 g/L（灭菌时，葡萄糖与其他成分分开灭菌）。
1.1.3 仪器设备
可见分光光度计（UNIC-UV2100）、电热恒温培养箱（DHP-9052B，上海一恒科学仪器有限公司）、立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX-30FBS，上海申安医疗器械厂）、电子天平（ACR120，梅特勒-托利多仪器）、摇床（HNY-2112F，天津欧诺仪器股份有限公司）、电热鼓风干燥箱（DHG-9140A，上海一恒科学仪器有限公司）、离心机（LXJ-IIB，飞鸽牌）、数显恒温水浴锅（HH-4，瑞华仪器制造有限公司）。
1.1.4 药品
亚硒酸钠、硫酸镁、亚硒酸、盐酸苯肼、变色酸、3，5-二硝基水杨酸，成都艾科科技有限公司；
EDTA二钠、氯酸钾、高氯酸、浓盐酸、浓硝酸、葡萄糖、重苯酚、亚硫酸钠、硫酸氢二钾，国药集团化学试剂有限工商网；
酵母浸出膏、蛋白胨、氢氧化钠、酒石酸钾钠，北京奥博星生物技术有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 菌株生长曲线的绘制
将石蜡管封存的菌种接种在斜面培养基中，培养12 h后挑取一环接于种子培养基中，培养18 h后按8%接种量接种于发酵培养基中，然后每2 h取样1次，样品稀释10倍，测定在600 nm处的吸光度，绘制标准曲线。
1.2.2 硒质量浓度对酵母富集有机硒的影响
设置初始硒质量浓度为0，5，10，15，20，25，30 μg/mL，装液量为40 mL/250mL广口三角瓶（下同），初始pH 6.0，培养时间35 h，温度29 ℃，转速200 r/min。在发酵对数期后期（12 h）向培养基中添加Na2SeO3[14]，发酵至35 h时，取出发酵液，离心洗涤3次，测定生物量和硒含量。
1.2.3 硒添加方式对酵母富集有机硒的影响
设置5组试验方案：①在12 h一次性添加10 μg/mL Na2SeO3；
②分别在12 h 和 16 h 添加5 μg/mL Na2SeO3；
③在 12 h 一次性添加 15 μg/mL Na2SeO3；
④分别在12 h和16 h添加5 μg/mL和10 μg/mL Na2SeO3；
⑤分别在12 h和16 h添加10 μg/mL和5 μg/mL Na2SeO3。发酵条件按照1.2.2试验中最优方案操作。
1.2.4 初始pH对酵母富集有机硒的影响
调节发酵培养基初始pH分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，发酵条件按照1.2.3试验中最优方案操作，发酵完毕后测定生物量和硒含量。
1.2.5 摇瓶装液量对酵母富集有机硒的影响
设置装液量分别为30、35、40、45、50、55、60 mL 7个梯度，试验方案按照1.2.4试验中最优方案操作，发酵完毕后测定生物量和硒含量。
1.2.6 正交试验
根据上述单因素试验，选择硒质量浓度（μg/mL），接种量（%），培养基初始 pH，装液量（mL）4个因素，制定3个水平，进行L9（34）正交试验，正交试验表如表1所示。
表1 正交试验实施表
1.2.7 发酵罐分批培养
试管斜面活化12 h后接种于种子培养基中培养18 h，然后按10%接种量接于发酵罐中，装液量为4 L/7 L发酵罐，温度为29 ℃，通过自动流加3 mol/L H2SO4或3 mol/L NaOH进行调节，pH恒定为5.5，初始搅拌转速为300 r/min，溶氧控制在30%，接种0.5 h后与转速偶联。每2 h取一次样，测定糖含量和生物量。
1.2.8 发酵罐分批补料培养
前期同分批培养，在葡萄糖消耗完后以 100 mL/h流加补料培养基补料10 h。每2 h取样一次，测定生物量和残糖量。
1.2.9 发酵罐分批补料加硒试验
培养条件与方法同分批补料培养，在26 h和37 h 分别加入 Na2SeO320 μg/mL 和 10 μg/mL，测定硒含量。
1.3 指标分析方法
1.3.1 酵母生物量（DCW）的测定[14]
取30 mL发酵液于50 mL离心管中，3 000 r/min离心10 min，蒸馏水离心漩涡震荡洗涤3次，将得到的湿菌体于80 ℃烘箱中烘干至恒重，计算酵母细胞干重。
1.3.2 葡萄糖浓度的测定
采用3，5-二硝基水杨酸法[15]。
1.3.3 硒含量的测定
采用催化分光光度法[16]。
发酵液中总有机硒含量（μg/L）＝菌体有机硒（μg/g）×DCW（g/L）
发酵液中有机硒得率/%＝发酵液中总有机硒含量（μg/L）/初始添加的无机硒质量浓度（μg/L）
2.1 菌株生长曲线
研究表明，酵母细胞在对数期吸收硒的能力最高[17]。由菌株生长曲线可知，酵母在培养 12 h时开始由对数期进入稳定期（图1）。因此选择在培养时间12 h时加入无机硒Na2SeO3。
图1 菌体生长曲线
2.2 硒质量浓度对酵母富集有机硒的影响
由图2可知，在硒质量浓度0～30 μg/mL范围内，随着硒质量浓度的增加，酵母生物量逐渐下降，由9.893 g/L下降至3.908 g/L，可见无机硒对酵母的生长具有抑制作用，且质量浓度越大，这种抑制作用越强。在硒质量浓度为25 μg/mL和30 μg/mL时，发酵液颜色略显红色，这是由于处于较高的质量浓度时，无机硒被还原为单质硒，致使发酵液颜色呈红色。在硒质量浓度为20 μg/mL时，总有机硒含量最高，达到9 954.4 μg/L，但有机硒得率（49.77%）和生物量（4.75 g/L）普遍比硒质量浓度为15 μg/mL（有机硒得率56.8%，生物量5.84 g/L）时偏低。由于所获得的产品为菌液，在获得有机硒越来越多的同时，应保证菌液中无机硒不能增长过快，否则对饲养动物有较大毒害作用。因此，选择15 μg/mL为最适硒添加质量浓度。
图2 硒质量浓度对酵母富集有机硒的影响
2.3 硒添加方式对酵母富集有机硒影响
由图3可知，从发酵液中总有机硒含量、DCW两个指标来看，在培养12 h一次性加入无机硒15 μg/mL时，两个指标在5组数据中均最高。因此，在后续试验中，选择培养12 h时一次性加入无机硒 15 μg/mL。
图3 硒添加方式对酵母富集有机硒的影响
2.4 初始pH对酵母富集有机硒的影响
pH对酵母细胞膜的透性有重要影响，从而影响酵母对硒元素的生物转化。由图4所示，初始pH对酵母生物量及硒富集量均有一定的影响。pH过低或过高都会抑制酵母的生长和对硒的吸收，当培养基初始pH值为6.0时，发酵液中总有机硒含量最高。因此，后续试验中培养基适宜的初始pH为6.0。
图4 初始pH对酵母富集有机硒的影响
2.5 摇瓶装液量对酵母富集有机硒的影响
由图5可知，摇瓶装液量越多，越有利于菌株对硒的富集，但得到的生物量较少，而摇瓶装液量越少，菌体对硒的富集量越少，但有较高的生物量。根据发酵液中总有机硒曲线，可知当装液量为40 mL时，其发酵液中总有机硒含量较高，达到 9 821.75 μg/L。因此，选择最适装液量为40 mL。
图5 摇瓶装液量对酵母富集有机硒的影响
2.6 正交试验结果分析
张帆等[18]研究表明，在单因素试验基础上，Na2SeO3质量浓度、初始pH和培养温度对产朊假丝酵母富硒工艺的影响较大，本试验选取这3个因素对提取工艺进行优化。由表2可见，在发酵液中总有机硒和菌体有机硒的影响因素方面，各因素所占比重有所不同，5号试验组的发酵液中总有机硒含量最高，达到9 792.732 μg/L，8号试验组的菌体有机硒含量最高，为2 643.071 μg/g。以发酵液中总有机硒含量为分析对象，各因素的比重大小依次为：硒质量浓度＞接种量＞装液量＞初始pH。以发酵液中总有机硒含量来看，5号试验组最好，可以达到菌体有机硒含量和生物量之间的平衡，即：硒质量浓度15 μg/mL、接种量8%、初始pH 6.5、装液量为35 mL。此时发酵液中的总有机硒含量为9 792.732 μg/L，菌体有机硒含量为1 400.362 μg/g。
表2 正交试验结果分析表
以菌体有机硒为分析对象，各因素的比重大小依次为：硒质量浓度＞初始pH＞装液量＞接种量，并且硒质量浓度是两个指标的最重要影响因素。这是因为硒质量浓度越大，对生物量产生的抑制作用越大，造成生物量减少，虽然单位菌体有机硒含量高，但生物量较少，导致发酵液中总有机硒含量也不是很高[19]。
2.7 分批培养结果分析
由图 6可知，产朊假丝酵母开始发酵在第 6小时进入对数期，葡萄糖消耗明显加快，直到发酵12 h时糖量基本耗尽，在18 h后生物量趋于稳定，并在24 h时达到最大，为13.07 g/L。因此，在分批补料培养时，在12 h左右开始补料为宜。
图6 分批培养生物量和残糖量
2.8 分批补料培养结果分析
补料分批培养比分批培养具有明显的优势[20]，这种培养方式解除了底物抑制、产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应，从而提高了产率。由图 7可知，葡萄糖在11 h时基本耗尽，此时开始补料。在开始补料前6小时残糖量处于较低水平，但在后4小时残糖量上升较快，并在停止补料后残糖量缓慢下降。初步分析在补料前6小时酵母迅速繁殖，对发酵液中的溶解氧要求越来越多，而在补料后期发酵罐中溶解氧满足不了菌量的需求，补料时溶解氧降至0，酵母细胞在缺氧条件下，菌体进行无氧呼吸，葡萄糖利用率下降，不再进行繁殖，这可能也是在补料后期残糖量上升的原因之一，此时很难获得较高的生物量[21]。发酵罐供氧不足也是影响酵母高密度培养的一个重要因素。在后续试验中，可以利用纯氧来缓解供氧的不足。
图7 分批补料培养生物量和残糖量
2.9 分批补料加硒试验结果分析
由表3可知，随着培养时间的延长，36 h和48 h时总有机硒含量和有机硒得率均比30 h和42 h高，在48 h时发酵液中总有机硒含量为10 089.00 μg/L。
表3 分批补料加硒试验结果分析表
本文以产朊假丝酵母为研究对象，将无机硒转化为有机硒，研究硒质量浓度、硒添加方式、初始pH、摇瓶装液量对酵母富集硒的影响，以这些单因素的试验结果来分析设计L9（34）正交表以进一步优化培养条件，获得发酵液中总有机硒含量最高时的培养条件，即：硒质量浓度15 μg/mL、接种量8%、初始pH 6.5、装液量为35 mL，此时总有机硒含量为9 792.732 μg/L，相比于邹艳等[22]的总有机硒含量为8 790 μg/L有所提高。菌体有机硒最高时的条件为：硒质量浓度20 μg/mL、接种量8%、初始pH 5.5、装液量45 mL，菌体有机硒含量为2 750.41 μg/g，此时生物量为3.1 g/L。本研究在发酵罐分批培养过程中也获得比较满意的结果，但在获得高浓度菌体方面还有待于进一步研究优化。
猜你喜欢 中总补料发酵液 树脂型沥青冷补料制备及性能研究山西交通科技(2022年3期)2022-08-02灭菌温度对产腈水合酶菌发酵生产的影响科学与信息化(2022年6期)2022-03-30酪酸梭菌-糯米复合发酵液对鼠伤寒沙门菌的抑制作用及其对鼠伤寒沙门菌感染小鼠肠道分泌型免疫球蛋白A的影响新乡医学院学报(2022年2期)2022-03-22反应型冷补料与溶剂型冷补料路用性能对比研究公路与汽运(2022年1期)2022-03-05利用残次果发酵液提升梨果品质中国果业信息(2021年10期)2021-12-07代谢参数指导补料速率提升糖化酶发酵水平食品研究与开发(2021年22期)2021-12-06沥青路面坑槽冷补材料的评价与应用科技视界(2020年22期)2020-08-14“中总”担当：一切为了人民健康党员生活(2020年4期)2020-07-04食用菌发酵液中水溶性糖类含量的检测研究食品界(2019年8期)2019-10-07正交试验法优化苦豆子总生物碱的超声提取工艺中国民族民间医药·下半月(2014年4期)2014-09-26