李 斌 陈 晶△ 张 聿 杨 静 姜雅洁 杨浩天 奇佳欣 刘玥欣 马添颖 赵孟乙 高 灏
（包头医学院，1 基础医学与法医学院，2 2019级临床本科，3 2018级临床本科，包头 014040）
近年来，甲状腺疾病发病率逐年增高，据统计全球甲状腺疾病人群发病率约5%~8%[1]，我国甲状腺疾病患病率也呈逐年攀升态势[2-4]，尤其在青壮年人群和育龄期妇女中甲状腺疾病的发病率尤为明显增高[5]，对来自中国31个省区的78 470名年龄在18岁或以上的调查研究显示，显性甲状腺功能亢进（甲亢）发病率0.78%，亚临床甲亢0.44%，格雷夫斯病0.53%，显性甲减1.02%[6-7]。甲状腺疾病中甲亢的发病率也呈逐年增加，在欧洲甲亢的患病率为0.8%，在美国为1.3%[8]，到2014年我国甲亢患者超过1000万，甲亢的患病率近2%[8-9]。甲亢男女发病比例为1∶6，其中80%患者为中青年女性，而甲状腺疾病知晓率、治疗率却比较低[10]，如甲亢未得到控制时妊娠，可能引起新生儿低体质量、生长发育受限、早产率增高等症状[11]。Matsumoto等[12]报道1例重度的母源性甲亢导致胎儿甲亢并出现心力衰竭。本课题组前期研究结果也表明，母源性甲亢会对仔鼠心造成一定的影响[13-14]。过量的甲状腺激素通过何种信号通路途径影响仔鼠心，相关研究较少。
1.1 实验动物及造模
成年Wistar雌性大鼠30只（购于中国军事医学科学院实验动物中心（SCXK 2002-0004），体质量180~210 g；
成年雄鼠6只（购于中国军事医学科学院实验动物中心（SCXK 2002-0004），280~320 g。室温18~25℃，相对湿度50%~70%，动物室保持清洁通风。实验动物适应性饲养1周，雌性大鼠随机分为甲亢组和对照组，甲亢组20只，对照组10只，连续经口灌胃给药，1次/天。模型组按100 mg·kg-1·d-1灌胃甲状腺素片（山东中泰药业股份有限公司），对照组灌服生理盐水 10 mL·kg-1·d-1。每天记录饮食、饮水量，行为指征；
每隔3天称量体质量，调整给药量。发现行为指征出现甲亢症状，眶静脉采血2~3 mL，采用竞争性放射免疫分析方法检测游离三碘甲腺原氨酸（FT3）、游离四碘甲腺原氨酸（FT4）（山东潍坊市三维诊断技术有限公司，20100105B）。检测确定甲亢后，挑选发情期雌鼠与雄鼠2∶1合笼，次日晨行阴道涂片检查，镜下发现有精子视为交配，并记为孕0天，受孕期间继续灌胃。
1.2 取材、解剖检查及形态学检查
分别取出生10 d仔鼠心脏。肉眼观察有无外观畸形及内部分隔畸形。取左心室心肌组织分别浸入Bouin氏固定液和10%中性甲醛溶液中，常规脱水、包埋，石蜡切片，分别行Masson染色和H-E染色，置于光学显微镜下观察。取1 mm3的组织块浸入2.5%戊二醛和1%锇酸双重固定，环氧树脂包埋，制成超薄切片，再用柠檬酸铅、醋酸铀双重染色后，透射电子显微镜下观察。
1.3 实时定量PCR检测
1.3.1 总RNA提取及逆转录 取心脏组织，液氮速冻后，提取总RNA（TaKaRa RNAiso Plus），对其进行完整性检测和浓度测定，然后用反转录试剂盒（TaKaRa PrimeScript®RT Reagent Kit）反转录成cDNA，-20℃保存。
1.3.2 合成引物和内参 引物和内参由上海生工合成，序列如表1所示。
表1 实时定量PCR引物序列
1.3.3 实时定量PCR 使用TaKaRa SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ RT-PCR kit，使用ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System。反应体系为SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，Primer各0.4 μL（20 μmol/L），ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，模板1 μL，dH2O 7.8 μL，共20 μL。将cDNA样 品模板进行5倍梯度稀释，制作标准曲线，寻找最佳PCR扩增循环条件，每个样品重复3次。最终循环条件为：①预变性：95℃ 30 s；
②PCR反应：40个循环，95℃ 5 s，60℃ 30 s。反应结束后确认 实时定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，确认产物特异性。
1.4 免疫印迹检测ERK的表达
使用RIPA裂解液（北京碧云天）提取心肌组织的总蛋白质，使用BCA试剂盒（北京碧云天）进行蛋白质定量。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）后转膜，封闭，洗膜。以稀释后的单克隆一抗（1∶500，Santa Cruz）4℃孵育过夜，再与二抗（1∶2000，Santa Cruz）反应1 h。使用ECL化学发光试剂盒（北京碧云天）显色。
1.5 统计学处理
数据使用SPSS 11.5分析，进行配对t检验，采用±s表示。计算基因相对表达量采用2-ΔΔCt法，即由PCR反应曲线得到Ct值，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）实验组-（Ct目的基因-Ct管家基因）对照组。
2.1 造模
甲亢组大鼠出现易怒好斗、饮食饮水量多，部分大鼠毛色枯槁，对照组未见异常。在造模之前和之后称重大鼠的体质量。实验后对照组大鼠体重自然增长，平均增长约（36.60±3.76）g；
甲亢组增长缓慢，平均增长约（23.50±8.75）g，差异极显著（P=0.01）。甲功检测结果显示甲亢组FT3为（6.72±1.68）pmol/L，对照组为（4.05±0.58）pmol/L，差异极显著（P=0.000）；
甲亢组FT4为（18.59±5.27）pmol/L，对照组为（10.23±1.81）pmol/L（P=0.000），差异极显著。
2.2 形态学检查结果
所有仔鼠中肉眼下未检出明显心脏外观畸形，心脏分隔也未见明显异常。经Masson染色，胶原纤维被染为蓝色。从图中可见，甲亢组仔鼠心肌细胞排列不整齐，心肌间胶原纤维等结缔组织增多（图1-B1、B2）。透射电镜观察发现母源性甲亢仔鼠心肌细胞体积增大，线粒体大小不均、形态不规则（图1B3）；
对照组心肌细胞排列整齐，线粒体呈椭圆形、大小均匀、排列整齐（图1A3）。
图1 仔鼠心肌组织光镜、电镜图
2.3 实时定量PCR结果
实时定量PCR检测结果显示，母源性甲亢仔鼠心肌中ANP、BNP、β-MHC在mRNA水平的表达量均有显著上调，其中ANP的表达量比正常仔鼠上调了约50%，BNP mRNA的表达量比正常仔鼠上调了约80%，β-MHC mRNA的表达量比正常仔鼠上调了约58%（图2）。母源性甲亢仔鼠心肌ERK1 mRNA的表达量比正常仔鼠上调了约30%（图2D）；
CaMK-Ⅱ、PI3K、STAT-3在各组仔鼠心肌中的表达量无显著性差异（图2E、2F、2G）。
2.4 ERK1、CaMK-Ⅱ、PI3K、STAT-3表达
免疫印迹检测结果显示母源性甲亢仔鼠心肌组织中ERK1的表达量高于对照组，CaMK-Ⅱ、STAT-3、PI3K的表达无显著性差异。
大量研究表明在结扎腹主动脉建立的小鼠心肌肥厚模型中，心肌组织中的ANP、BNP、β-MHC mRNA水平表达升高[15-18]。本研究在Wistar雌性大鼠持续灌胃甲状腺素后受孕分娩的仔鼠中也发现心肌组织中存在ANP、BNP、β-MHC mRNA水平的高表达；
电镜超微结构结果也显示母源性甲亢仔鼠心肌细胞体积增大，线粒体大小不均、形态不规则。结果提示母体过量的甲状腺素可以对仔鼠心肌组织产生影响。
产妇甲亢时，胎儿组织暴露于过量的甲状腺激素，这可能会破坏胎儿和新生儿调节促甲状腺激素（TSH）和T4水平的能力[19]。Ribeiro等[20]认为母体通过胎盘和乳汁转移多余的母体甲状腺素可能导致新生儿甲亢，胎儿下丘脑-垂体-甲状腺系统暴露于高浓度的母体甲状腺素，甚至在胎儿没有甲亢的情况下，可能会损害胎儿的生理成熟。过量的甲状腺素又是如何影响新生儿心脏的呢？相关报道较少。甲状腺素除了可以通过与位于靶基因启动子上的保守甲状腺素反应元件相关的核甲状腺激素受体结合而发挥作用，还可能通过“非基因组作用”对细胞内信号通路具有新的作用[15，21]。有研究认为T4可以结合到未能识别的膜受体，在10~30 min内，激活Ras、Raf1、MEK和PKC导致酪氨酸磷酸化，激活MAPKs核转录[22]。母源性甲亢是否会通过某种细胞内信号通路发挥作用呢？
图2 各相关基因在仔鼠心肌组织中mRNA水平的相对表达量
图3 ERK1在仔鼠心肌组织中的表达
本研究中发现母源性甲亢仔鼠心肌组织中ERK1表达上调。在哺乳类动物细胞中，与ERK相关的细胞内信号转导途径被认为是经典MAPK信号转导途径，ERK即细胞外调节蛋白激酶，主要包括ERK1和ERK2。在ERKs的传递途径中Ras作为上游激活蛋白，Raf作为MAPKKK，MAPK/ERK激酶（MEK）作为MAPKK，ERK即MAPK，即Ras-Raf-MEK-ERK途径。研究表明，异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌组织 p-Raf与p-ERK1/2表达明显增多，认为p-Raf与p-ERK1/2是心肌肥厚的正性调节因子[23]。本研究结果也表明母源性甲亢会引起心肌肥厚相关基因ANP、BNP、β-MHC的高表达。然而过量的甲状腺激素又是如何引起ERK的差异表达的，ERK又将如何影响其下游转录因子，还有待下一步深入研究。
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