范华，易亭伍，马闻，杨茜，田静
食管癌是全球常见的恶性肿瘤，全世界每年新发约50万例，占所有肿瘤相关死亡的5.3%[1]。其以鳞癌为主，占病理类型90%以上。目前治疗包括手术、放疗及联合治疗等，但由于肿瘤异质性，部分患者治疗后仍可出现肿瘤复发、转移，导致不良预后[2]。微小RNA-452-5p(microRNA-452-5p，miR-452-5p)基因位于Xq28，是一种长度为20～24个核苷酸的微小RNA。近年来发现，miR-452-5p在结直肠癌、肝细胞癌等恶性肿瘤中异常表达[3-4]，其通过促进丝裂原活化蛋白激酶途径，促进肿瘤的恶性增殖。SRY盒相关基因7 (SRY-box containing，SOX7)编码蛋白属于SRY相关HMG盒转录因子家族成员，参与胚胎发育及细胞死亡的调节。研究发现，SOX7能够通过调节Wnt/β连环蛋白途径，影响肝癌、口腔鳞癌等恶性肿瘤的侵袭转移及血管拟态等生物学行为[5-6]，在肿瘤恶性进展中发挥重要功能。现分析食管癌miR-452-5p、SOX7 mRNA表达及其与临床病理特征及预后的关系，报道如下。
1.1 临床资料 选取2018年1月—2019年1月四川省乐山市人民医院肿瘤血液科诊治的食管癌患者103例为研究对象，男65例，女38例，年龄34～78(56.1±6.3)岁；
肿瘤分化程度：高中分化58例，低分化45例；
肿瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期69例，Ⅲ期34例；
肿瘤位置：上胸段19例，中胸段55例，下胸段29例；
肿瘤直径：≤5 cm 47例，>5 cm 56例；
伴淋巴结转移42例，均无明显诱因及家族遗传史。本研究经医院伦理委员会审核批准通过(2018-025)，患者及家属对本研究知情同意并签署知情同意书。
1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①经活检或术后组织病理学检查明确诊断为食管鳞癌；
②首次诊治；
③患者能够配合相关诊治及随访。(2)排除标准：①合并其他器官恶性肿瘤；
②合并严重肝、肾等脏器功能障碍；
③合并类风湿性关节炎等自身免疫性疾病。
1.3 观测指标与方法
1.3.1 miR-452-5p与SOX7 mRNA的表达检测：应用荧光定量PCR检测组织中miR-452-5p与SOX7 mRNA的表达。术中获取癌灶及癌旁组织(距肿瘤边缘2 cm以上)，应用Trizol法提取组织中总RNA，将总RNA反转录合成cDNA，试剂盒购自日本TAKARA公司。反转录条件为42℃ 120 min，90℃ 5 min。然后进行荧光定量PCR反应。引物序列由上海生工公司设计合成。miR-452-5p引物序列：上游5’-GCCGAGAACTGTTTGCAGA-3’，下游 5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAG-3’；
内参U6上游5’-AGTAAGCCCTTGCTGTCAGTG-3’，下游5’-CCTGGGTCTGATAATGCTGGG-3’；
SOX7上游5’-AGCCGGAGCAGACCTTCTT-3’，下游5’-GCCGGGGAGTAATAGGCAG-3’；
内参GAPDH上游5’-TCGACGCCCTGGATCAACT-3’，下游5’-CTGGGAGACCGGAACATGC-3’。
miR-452-5p反应条件为：95℃ 30 s、95℃ 5 s、62℃ 30 s、70℃ 30 s，共35个循环; SOX7 mRNA反应条件为：94℃ 5 min、94℃ 30 s、62℃ 30 s、70℃ 30 s，共40个循环。反应体系：SYBR Green premix 10 μl，上下游引物各1 μl，cDNA 模板1 μl和ddH2O 7 μl(miR-452-5p)；
SYBR Green premix 10 μl ，上下游引物各1.2 μl ，cDNA 模板2 μl 和ddH2O 5.6 μl(SOX7 mRNA)。miR-452-5p表达以U6为内参，SOX7 mRNA以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法表示miR-452-5p、SOX7 mRNA的相对表达量。分别以miR-452-5p、SOX7 mRNA相对表达量的平均值3.04、1.27作为阈值, 分为miR-452-5p高表达组53例和低表达组50例；
SOX7 mRNA高表达组52例和低表达组51例。
1.3.2 随访情况：患者自出院起开始随访，以门诊复查或电话方式回访，每3个月随访1次，连续随访3年，统计患者生存情况。随访截止至2022年2月1日，随访终点为患者死亡或随访时间结束。
2.1 癌组织与癌旁组织miR-452-5p、SOX7 mRNA表达比较 癌组织中miR-452-5p的表达明显高于癌旁组织，SOX7 mRNA的表达明显低于癌旁组织，见表1。
表1 癌组织与癌旁组织miR-452-5p、SOX7 mRNA表达比较
2.2 食管癌组织miR-452-5p与SOX7 mRNA表达的相关性 Pearson相关分析结果显示，食管癌组织中miR-452-5p与SOX7 mRNA表达呈显著负相关(r=-0.504，P<0.001)。
2.3 miR-452-5p与SOX7 mRNA表达在不同食管癌临床/病理特征中比较 肿瘤分期Ⅲ期、低分化、伴淋巴结转移癌组织中miR-452-5p表达明显高于Ⅰ～Ⅱ期、高中分化、无淋巴结转移者，而SOX7 mRNA表达低于肿瘤Ⅰ～Ⅱ期、高中分化及无淋巴结转移患者(P均<0.01)；
不同性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤位置间miR-452-5p、SOX7 mRNA表达比较，差异无明显统计学意义(P均>0.05)，见表2。
表2 103例食道癌患者miR-452-5p、SOX7 mRNA表达在不同临床/病理特征中比较
2.4 miR-452-5p、SOX7 mRNA表达与食管癌临床预后的关系 103例食管癌患者随访5～36个月，中位随访时间28个月，随访期间死亡60例，无失访。miR-452-5p高表达组患者中位生存时间明显低于低表达组患者，差异有统计学意义(26.15 vs. 31.22个月,χ2=3.967,P=0.046)。miR-452-5p高表达组患者3年总体生存率为24.53% (13/53)，明显低于低表达组患者的60.00% (30/50)，差异有统计学意义(χ2=5.093，P=0.024)，见图1。
图1 不同miR-452-5p表达食管癌患者Kaplan-Meier生存曲线
SOX7 mRNA低表达组患者中位生存时间明显低于高表达组患者，差异有统计学意义(27.47 vs. 32.40个月,χ2=3.941,P=0.047)。SOX7 mRNA低表达组患者术后3年总体生存率为23.53% (12/51)，明显低于高表达组患者的59.62% (31/52)，差异有统计学意义(χ2=5.285,P=0.022)，见图2。
图2 不同SOX7 mRNA表达食管癌患者Kaplan-Meier生存曲线
2.5 食管癌临床预后的影响因素分析 以食管癌患者的生存预后为因变量(1=死亡，0=存活，t=生存时间)，纳入年龄(1=≥60岁，0=<60岁)、性别(1=男，0=女)、肿瘤大小(1=>5 cm，0=≤5 cm)、肿瘤位置(1=上胸段，0=中下胸段)、肿瘤分期(1=Ⅲ期，0=Ⅰ～Ⅱ期)、分化程度(1=低分化，0=高中分化)、淋巴结转移(1=有，0=无)、miR-452-5p(1=高表达，0=低表达)、SOX7 mRNA(1=高表达，0=低表达)为自变量纳入单因素COX比例风险回归模型，结果显示肿瘤TNM分期、分化程度、淋巴结转移、miR-452-5p、SOX7 mRNA是影响食管癌预后的因素。多因素COX回归分析结果显示，TNM分期Ⅲ期、分化程度低、伴淋巴结转移、miR-452-5p高表达及SOX7 mRNA低表达是影响食管癌预后的独立危险因素，见表3、4。
表3 食管癌临床预后的单因素COX比例风险回归模型分析
表4 食管癌临床预后的多因素COX比例风险回归模型分析
我国食管癌每年发病例数达24.6万，死亡达18.8万例，占全世界发病和死亡人数的50%以上，严重威胁我国人民健康[7]。目前食管癌的临床治疗是以外科治疗为主的综合治疗，但对于中晚期患者，丧失最佳手术治疗时机，术后复发转移率较高，远期生存预后较差[8]。因此，深入研究食管癌的病因和发病机制，寻找预后相关分子标志物，有助于食管癌的临床诊治及预后判断。
miR-452-5p属于非编码RNA，参与构成RNA诱导的沉默复合物，通过不完全碱基配对来识别靶基因mRNA，导致靶基因mRNA的稳定性降低及翻译抑制[9]。近年来发现，miR-452-5p在前列腺癌[10]、结直肠癌[11]等肿瘤中表达上调或下调，其通过调节转化生长因子β信号通路，促进肿瘤的恶性进展。本研究中，食管癌组织中miR-452-5p表达上调，提示miR-452-5p可能参与食管癌的发生过程。研究发现，环状RNA CCDC66能够作为分子海绵结合并抑制miR-452-5p的表达，环状RNA CCDC66的表达下调促进miR-452-5p的表达，进而导致肿瘤进展[11-13]。本研究中，miR-452-5p表达与肿瘤分期、分化程度、淋巴结转移有关，提示miR-452-5p的表达升高参与促进食管癌恶性进展。研究报道，miR-452-5p表达上调通过磷酸化Rho相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，激活细胞外调节MAP激酶/丝裂原活化蛋白激酶信号通路，促进肿瘤细胞周期的进行，导致肿瘤的过度增殖[3]。此外，尚有研究发现，miR-452-5p的表达能够激活转化生长因子β通路，促进肌动蛋白细胞骨架组装进而促进肿瘤细胞的侵袭、迁移和黏附能力，导致肿瘤的局部侵犯和远处转移的发生[10]。因此，食管癌中miR-452-5p可能作为一种促癌因子，促进食管癌的肿瘤进展。本研究中，miR-452-5p高表达患者生存预后较差，其原因可能与miR-452-5p能够促进肿瘤细胞耐药性的形成有关。有学者发现，miR-452-5p表达升高能够过度激活SMAD家族蛋白4/7，增强肿瘤细胞对酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼的治疗抵抗，降低患者对治疗的反应性，导致患者不良预后[14-16]。
SOX7结构上包含DNA结合的高迁移率基团结构域，其在胚胎干细胞分化、血管形成及个体发育过程的调控中发挥重要作用[17]。近年来发现，SOX7在宫颈癌、肾癌等恶性肿瘤中表达明显下调[18-19]，其作为一种肿瘤抑制基因，能够负调控Wnt/β-连环蛋白信号传导，抑制癌细胞中的细胞增殖。本研究中，食管癌组织中SOX7表达降低，可能与miRNA的表达调控有关。有研究报道，miR-492能够结合SOX7 mRNA的3"端非编码区，降低SOX7 mRNA的稳定性，抑制SOX7的蛋白表达，进而促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，导致肿瘤细胞的迁移和侵袭[20-21]。本研究中，癌组织中SOX7 mRNA的表达与肿瘤分期、分化程度及淋巴结转移有关，表明SOX7 mRNA表达降低促进食管癌的肿瘤发展。其机制可能与SOX7对下游多种靶基因的表达调控有关。研究发现，SOX7能够与β-连环蛋白相互作用，促进β-连环蛋白的降解，抑制β-连环蛋白介导的转录共激活因子BCL9的表达，而SOX7的表达下调激活β-连环蛋白/BCL-9通路，导致肿瘤细胞的过度增殖及转移[22]。此外，尚有研究发现，SOX7能够转录激活层粘连蛋白α1的表达，增强细胞之间的黏附性，而肿瘤中SOX7的表达降低导致肿瘤细胞的侵袭和转移能力增强，促进肿瘤的恶性进展[23]。本研究进一步分析发现，食管癌中SOX7 mRNA低表达患者预后较差，并且是患者不良预后的独立危险因素。有学者发现，SOX7的表达下调能够促进B细胞淋巴瘤-2和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶磷酸化，增强肿瘤细胞对紫杉醇类化疗药物抵抗性，导致患者不良预后[24]。
本研究还发现，食管癌组织中miR-452-5p与SOX7 mRNA表达呈显著负相关，提示两者可能存在相互调控的关系。实验研究表明，食管癌细胞KYSE-150中miR-452-5p表达显著上调，其通过结合SOX7 mRNA 3’非编码区，降低SOX7 mRNA稳定性，抑制SOX7 mRNA的表达，并激活Wnt/β-连环蛋白信号通路，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭及上皮间质转换[25]。因此，食管癌中miR-452-5p可能通过抑制SOX7 mRNA的表达，发挥促进肿瘤恶性进展的功能。
综上所述，食管癌组织中miR-452-5p表达升高，SOX7 mRNA表达降低，二者与肿瘤分期、分化程度及淋巴结转移有关，可能是新的食管癌预后相关肿瘤标志物。但本研究样本量有限，有待今后扩大样本含量，并设计前瞻性临床试验进一步研究miR-452-5p、SOX7 mRNA表达在食管癌中的临床应用价值。
利益冲突：所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明
范华：研究构思、数据获取、论文撰写、统计分析、论文修改；
易亭伍：选择课题、论文修改；
马闻、杨茜:数据获取；
田静：数据获取、统计分析、论文终审