李姝丽 吴秀祯 王志贤 盛长忠 周泽奇 陈龙
[1.天津大学医学工程与转化医学研究院，天津 300072; 2.天津市侵袭性真菌病精准诊断技术企业重点实验室，天津 300467; 3.丹娜(天津)生物科技股份有限公司，天津 300467; 4.天津科技大学轻工技术与工程学院，天津 300457]
烟曲霉(Aspergillusfumigatus)是导致曲霉病的最常见病原体，唑类药物如伊曲康唑、泊沙康唑和伏立康唑是治疗曲霉病的一线药物。近年来，随着唑类药物的广泛使用，全球范围内的烟曲霉耐药率迅速增加，严重威胁患者的生命安全[1]。烟曲霉唑类耐药机制有多种，其中最常见的是cyp51A基因突变导致蛋白质构象的变化[2-3]。常见的耐药检测方法主要包括基于分离培养的耐药检测、质谱、NGS技术和PCR技术。烟曲霉耐药机制的研究及耐药菌的鉴定对指导临床用药具有重要意义。文章对临床或文献报道的烟曲霉唑类耐药机制及检测方法进行总结。
唑类药物包括氟康唑、酮康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑等，是治疗曲霉病的一线药物。唑类药物通过非竞争性地抑制细胞膜中麦角固醇合成通路中的关键蛋白-羊毛甾醇14-α-去甲基化酶(Cyp51A)的活性，影响麦角固醇的生物合成，进而影响细胞膜的流动性和膜结合蛋白酶的活性，从而杀伤菌体[4]。
已报道的烟曲霉唑类耐药机制包括：Cyp51A蛋白构象改变或过表达、外排泵相关蛋白过表达、细胞应激反应和形成生物被膜等，其中由cyp51A基因突变引起的蛋白构象改变是最重要的耐药机制[5]。超过20种cyp51A点突变，如G54、G138、M220、G448等，可引起蛋白构象改变，致使唑类药物不能与之结合而产生耐药性[6-7]。另外，cyp51A基因的启动子区串联重复序列(tandem repeat，TR)，如TR34/L98H和TR46/Y121F/T289A可以使Cyp51A蛋白过量表达，从而增加菌体对唑类药物的耐受性，这种情况约占全部唑类耐药突变类型的80%[8]。
2.1 基于分离培养的耐药检测方法
分离培养是耐药检测的“金标准”，典型方法是标准肉汤稀释法和琼脂/纸片扩散法。美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)和欧洲药敏试验联合委员会(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)分别针对丝状真菌制定了标准化的药敏实验方法及判读标准[9]。
肉汤稀释法 肉汤稀释法是测定抗真菌药物最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)的标准方法。实验时，在微孔板中加入等量的真菌培养基和连续稀释的抗真菌药物，孵育一段时间后，通过观察培养基的浑浊度判断真菌的生长情况。目前，商业化产品有英国的Sensititre YeastOne®(TREK Diagnostic Systems, West Sussex, UK)显色药敏板，适用于念珠菌、曲霉和隐球菌等。它在每个稀释孔中加入了显色试剂，可根据培养液颜色的变化判断真菌的生长或抑制，其中红色表示生长、紫色表示生长抑制、蓝色表示无生长[10]。该方法可用于两性霉素B、氟胞嘧啶、多种棘白菌素类药物和伏立康唑、泊沙康唑等三唑类药物的抗真菌活性的测定[11]。
琼脂/纸片扩散法 基于琼脂/纸片扩散法的商业化产品中，最常用的是法国生物梅里埃公司的E-test®(Biomérieux, Marcy-l’Étoile, France)[12]。该方法是在试纸条上包被一定浓度梯度的抗真菌药物，将其置于涂有烟曲霉孢子悬浮液的平板中，孵育24～48 h后，会在平板上观察到椭圆形的生长抑制。该方法能够测定两性霉素B、氟胞嘧啶、卡泊芬净、伏立康唑、泊沙康唑等多种抗真菌药物对烟曲霉的MIC值[13]，在烟曲霉的耐药检测中广泛使用，常用于对肉汤稀释法药敏检测结果的复验。
基于分离培养的耐药检测方法得到的结果比较可靠、检测成本低，临床上广泛应用。但由于检测周期长、敏感性低、培养过程易污染，难以满足临床早期快速诊断的需求。
2.2 质谱检测方法
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionizationationtime of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是目前发展最快的耐药检测技术之一。该方法使用复合相关指数(composite correlation index，CCI)分析不同浓度药物压力下细胞产生的蛋白谱之间的相关性，得到最低药物浓度(minimal profile change concentration，MPCC)，近似于肉汤稀释法的MIC值[14]。该方法可准确检测出耐伏立康唑的烟曲霉菌株，并在检测烟曲霉对卡泊芬净的耐药性方面与肉汤稀释法有很好的一致性[15]。相较于真菌药敏实验，MALDI-TOF MS检测速度快、所需的样本量少、检测通量大、覆盖菌种范围广，非常适合临床实验室检测。但是MALDI-TOF MS数据分析依赖于强大的数据库资源，随着对真菌种类和耐药突变研究的不断深入，需对数据库进行持续更新。另外，不同地域的真菌病原种类及药物耐受情况不完全相同，因此有必要建立适合本地区的真菌病原生物质谱检测数据库[16]。目前，MALDI-TOF MS方法只能利用纯培养物，无法直接对临床样本进行检测，因此会延长检测周期[17]。此外，随着培养条件不同，峰值会发生一定变化，这增加了检测标准化的困难程度[18]。
2.3 NGS检测方法
二代测序(next generation sequencing，NGS)技术通过测定样本中的全部核酸序列，在全基因组水平上实现耐药突变位点的检测，这使临床核酸序列信息的使用提升到新的水平[19]。利用NGS技术能够检测临床分离株基因组中与耐药性有关的、可能被靶向DNA序列分析遗漏的新突变类型，在临床耐药真菌的检测方面具有很大潜力。目前它已经用于念珠菌中与唑类、棘白菌素类耐药相关的基因突变检测[20-22]，但在耐药烟曲霉鉴定方面的应用较少。Hagiwara等[23]曾经利用NGS技术对8株临床分离的烟曲霉进行耐药检测，发现其中4株携带基因突变，其中1株基因组中包含与伊曲康唑耐药相关的cyp51A(P216L)突变，进一步的检测发现了一个11个基因的缺失。而传统方法(如PCR方法或微卫星基因分型)则无法检测出这些突变。尽管NGS技术在耐药基因突变检测方面的优势明显，但其检测的精度取决于测序深度，现阶段检测单核苷酸突变的成本较高；
另外，临床样本尚不能进行直接检测且对操作人员专业性的要求很高，这使其在现阶段难以在临床上大规模应用[24]。
2.4 PCR检测方法
PCR，即聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)，通过检测cyp51A基因的典型耐药突变位点间接反映菌株的耐药性。
PCR方法中应用最普遍的是实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)与探针熔解曲线技术。在反应体系中加入多条经不同荧光基团标记的、覆盖不同耐药突变位点的TaqMan探针，待扩增结束后，对产物进行熔解曲线分析。随着体系中温度的升高，探针逐渐从模板链上脱落，有一半探针脱落时的温度为该探针与对应模板的Tm值。含有突变碱基的模板与探针的Tm值低于完全匹配的模板，因此能够通过Tm值的差异鉴定野生型和突变基因；
同时，可在一个体系中添加多条探针实现多个耐药靶点的同时检测[25]。
目前，基于实时荧光定量PCR方法的烟曲霉唑类耐药检测商业化产品包括AsperGenius®、MycoGenie®和Fungiplex azolus®(见表1)。这三款产品都能直接从临床样本中，同时进行曲霉种属鉴定和烟曲霉耐药检测，利用多重荧光PCR方法与熔解曲线分析cyp51A基因的耐药突变，选择的靶点分别是TR34/L98H和Y121F/T289A突变(AsperGenius®)、TR34/L98H(MycoGenie®)、TR34和TR46(Fungiplex azolus®)，其中AsperGenius®的靶点最全，对支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage，BAL)和血液样本中检测效果好，对其性能的报道最多。Chong等[26-27]曾经在2015年和2016年对AsperGenius®的检测效果进行报道，在19份来自血液病和ICU患者的BAL样本中，成功鉴定出16个曲霉阳性样本，其中14份为烟曲霉。对14份烟曲霉阳性样本进行耐药检测发现，12份为野生型，1份TR34/L98H突变，1份为TR46/Y121F/T289A突变。另外，在一项对201名疑似IA的血液病患者的多中心的前瞻性研究中，检出97例曲霉阳性，其中有68例(70%)耐药PCR鉴定阳性，其中7个样本中检测到TR34/L98H突变，1个样本中检测到TR46/Y121F/T289A突变，3个样本中同时检测到野生型和TR34/L98H突变组合。MycoGenie®缺乏TR46/Y121F/T289A靶点，影响其检测灵敏性，在呼吸道样本(n=88)敏感性和特异性为92.9%和90.1%，对于血清样本的敏感性和特异性为100%和84.6%[28]。qPCR方法无需获得纯的真菌培养物，直接通过扩增临床样本中的核酸，即时、快速、高效地对其进行耐药鉴定。
表1 商业化烟曲霉唑类耐药检测PCR产品[29]Tab.1 Commercial PCR assays for the detection of azole resistance in A. fumigatus
PCR扩增与基因测序联合使用也可用于临床烟曲霉的耐药检测。Trama等[30]直接对56份全血样本进行PCR扩增及焦磷酸测序，发现2份样本中含有cyp51A基因的G54突变。另外，一些没有被探针覆盖的突变位点可以通过测序方法检测到；
但是与商业化的qPCR检测产品相比，测序相对费时费力，不适于大量临床样本的检测。
新型的烟曲霉唑类耐药检测方法弥补了药敏实验敏感性低、耗时长的不足，但目前MALDI-TOF MS和NGS尚处于技术攻关时期，短期内无法满足临床诊断的需求，qPCR技术相对成熟，商业化的产品灵敏度高、检测成本低，更适于临床分级诊疗。但qPCR方法只能检测已知的耐药靶点，随着对耐药机制的深入研究，多种检测技术联合使用而形成的多维立体检测方案，有利于提高对耐药基因的早期诊断并为临床用药提供参考。
猜你喜欢 探针类药物真菌 多肽类药物药代动力学研究进展化工管理(2022年14期)2022-12-02LC-MS在真菌毒素检测中的研究进展食品安全导刊(2021年21期)2021-08-30Xpert MTB/RIF对结核菌利福平耐药的诊断价值及rpoB基因突变特点的分析临床肺科杂志(2021年5期)2021-04-27正电子类药物全自动核素分装仪的研究进展国际放射医学核医学杂志(2021年10期)2021-02-28研究他汀类药物联合中药治疗心血管疾病的临床实践中华养生保健(2020年2期)2020-11-16千奇百怪的真菌大自然探索(2019年1期)2019-01-24这类药物值得警惕祝您健康(2018年9期)2018-09-04气液鼓泡床反应器中气泡行为光纤探针测量方法北京航空航天大学学报(2017年2期)2017-11-24致命真菌大自然探索(2017年3期)2017-04-07真菌病害怎样正确选择杀菌剂?营销界(2015年23期)2015-02-28