杨 欣，鲁利群，贺 静，黄 莉，汪 燕
成都医学院第一附属医院儿科，四川成都 610500
新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)是导致新生儿死亡及神经系统发育障碍的重要因素。有研究表明，约有50%的脑瘫患儿是由于HIE所引起[1]。目前研究发现，早期对HIE进行治疗能够改善HIE患儿预后[2]，因此寻找HIE早期诊断的生物学标志物具有重要意义。微小RNA(miRNA)是一类具有调控功能的内源性小RNA分子，参与机体多种生理、病理过程[3]。研究表明，miR-30b、miR-199a在神经系统疾病中存在异常表达，与神经系统病变有密切关系[4-6]。神经元特异性烯醇化酶(NSE)、S100B蛋白、信号素3A(SEM3A)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)均是与神经系统疾病有密切关系的蛋白[7-9]。但目前关于血清miR-30b、miR-199a表达水平与HIE患儿神经损伤和预后的关系鲜有报道。本研究拟探讨血清miR-30b、miR-199a在HIE患儿中的表达及意义，现报道如下。
1.1一般资料 选择2018年1月至2020年6月本院收治的HIE患儿90例。纳入标准：(1)符合HIE的诊断标准[10]；
(2)足月出生儿，胎龄37～42周；
(3)母体妊娠期间无严重并发症。排除标准：(1)先天性颅脑畸形者；
(2)伴有颅内出血者；
(3)合并脑组织感染者；
(4)合并会影响研究结果的其他系统疾病者。根据患儿病情程度将其分为轻度组29例、中度组36例、重度组25例。另选择同期在本院出生的足月健康新生儿30例作为对照组。各组基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。入组新生儿家属均了解本研究内容并签署知情同意书，本研究经本院伦理委员会批准。
1.2方法
1.2.1检测标本采集及保存 于分娩后24 h内采集所有受试新生儿外周静脉血4 mL，在室温条件下静置10 min后，以4 000 r/min离心10 min，离心半径为12 cm，分离血清，并将分离的血清编号保存在-20 ℃冰箱中。
1.2.2血清miR-30b、miR-199a表达水平检测 应用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测血清miR-30b、miR-199a表达水平。取新生儿外周静脉血血清1 mL，应用Trizol法提取血清总RNA，Trizol试剂购自美国Invitrogen公司(生产批号20190392)，应用分光光度计测量样品浓度，再应用Taq Man RT kit(日本Takara公司生产，批号：190284)进行反转录，提取总RNA。应用TaqMan microRNA assay(广州锐博生物公司生产，批号190528)进行扩增反应，以U6为内参，引物序列由广州锐博有限公司合成，见表2。反应体系：cDNA底物1.33 μL，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10.00 μL，TaqMan microRNA assay 1.00 μL，ddH2O 7.67 μL。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共计45个循环，每个指标设置3个复孔重复3次，完成后通过2-ΔΔCt法计算miR-30b、miR-199a表达水平。
表2 miR-30b、miR-199a及内参U6的引物序列
1.2.3血清NSE、S100B蛋白、SEM3A、PAI-1水平检测 取剩余血清中1 mL应用电化学发光法测定血清NSE水平，测定仪器为罗氏ELecsys2017电化学发光仪，试剂盒购自罗氏公司，批号：180359J；
应用酶联免疫吸附试验测定血清S100B蛋白、SEM3A、PAI-1水平，试剂盒购自上海纪宁实业有限公司，批号：180719、180213、181104。严格按照试剂盒说明书进行操作。
1.2.4神经功能评估 于出生后30 d应用新生儿20项行为神经(NBNA)评分[11]评估所有受试新生儿的神经功能，该评分系统包括一般评估3项、行为能力6项、肌张力8项、原始反射3项，共20项，总分40分，评分越高表明神经功能越好。
1.2.5随访及预后评估 所有HIE患儿以门诊复查的形式随访1年，观察记录患儿神经发育情况。根据患儿预后情况将其分为预后良好组和预后不良组。患儿无神经系统异常、无智力缺陷为预后良好；
存在脑瘫、癫痫等神经系统疾病、智力缺陷或死亡则为预后不良。
2.1各组血清miR-30b、miR-199a表达水平及神经功能、神经损伤指标水平比较 HIE患儿的血清miR-30b、miR-199a表达水平及NBNA评分低于对照组(P<0.05)；
趋势检验显示病情越重，HIE患儿的血清miR-30b、miR-199a表达水平及NBNA评分越低(P<0.05)。HIE患儿的NSE、S100B、SEM3A、PAI-1水平高于对照组(P<0.05)；
趋势检验显示病情越重，HIE患儿的NSE、S100B、SEM3A、PAI-1水平越高(P<0.05)。见表3、4。HIE患儿血清miR-30b、miR-199a及内参U6 qRT-PCR扩增曲线见图1～3。
图1 miR-30b qRT-PCR扩增曲线
表3 各组血清miR-30b、miR-199a表达水平比较
表4 各组血清神经功能及神经损伤指标水平比较
续表4 各组血清神经功能及神经损伤指标水平比较
2.2HIE患儿血清miR-30b、miR-199a表达与神经功能及神经损伤指标水平的相关性 Pearson相关分析显示，HIE患儿血清miR-30b表达与NSE、S100B、SEM3A、PAI-1水平呈负相关(r<0，P<0.05)，与NBNA评分呈正相关(r>0，P<0.05)；
血清miR-199a表达与NSE、S100B、SEM3A、PAI-1水平呈负相关(r<0，P<0.05)，与NBNA评分呈正相关(r>0，P<0.05)。见表5。
表5 HIE患儿血清miR-30b、miR-199a表达与神经功能及神经损伤指标水平的相关性
2.3不同预后HIE患儿血清miR-30b、miR-199a表达及神经功能、神经损伤指标水平比较 共87例患儿完成随访，失访3例，根据患儿预后情况将其分为预后良好组60例，预后不良组27例。预后不良组的血清miR-30b、miR-199a表达水平及NBNA评分明显低于预后良好组，NSE、S100B、SEM3A、PAI-1水平则明显高于预后良好组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表6。
图2 miR-199a qRT-PCR扩增曲线
图3 U6 qRT-PCR扩增曲线
2.4影响HIE患儿预后的多因素Logistic回归分析 建立多因素非条件Logistic回归模型，以本研究HIE患儿为样本，HIE患儿的预后情况为因变量(预后良好=0，预后不良=1)，以表6中差异有统计学意义的指标为自变量，并以所有HIE患儿各指标均值为临界值(根据实际情况适当取整)，将各指标转化成二分类变量，赋值见表7。回归采用逐表后退法，α进=0.05，α退=0.10。回归结果显示：NSE≥35 g/L、S100B≥100 ng/L、SEM3A≥45 ng/mL、PAI-1≥100 pg/mL是HIE患儿预后不良的危险因素(P<0.05)，miR-30b≥0.85、miR-199a≥1.25、NBNA评分≥32分则是HIE患儿预后不良的保护因素(P<0.05)，见表7。
表6 不同预后HIE患儿血清miR-30b、miR-199a表达及神经功能、神经损伤指标水平比较
表7 影响HIE患儿预后的多因素Logistic回归分析
HIE是导致新生儿神经系统功能障碍和残疾的严重疾病，其致残率和致死率均较高，患儿常遗留共济失调、脑瘫、癫痫和智力障碍等后遗症，不仅给患儿的健康带来严重的威胁，也给家庭和社会带来了沉重的负担。HIE的早期诊断并及时对患儿的神经损伤程度进行判断，有助于降低患儿病死率，改善预后。目前临床上对于HIE的诊断主要包括颅脑超声检查、头颅CT检查、脑干听觉诱发电位检查及血清学检测等[12]。其中血清学检测具有操作简单、诊断迅速、可重复观察的优点，并且血清学指标的动态变化可以反映疾病发展情况，受到临床医生的青睐。
miRNA是一类单链非编码RNA，可以在组织和血液中稳定存在。研究表明，miRNA可以与靶基因的3′非编码序列结合，调控基因表达[13]。目前已有研究发现，在新生儿HIE发生、发展中存在miRNA的异常表达，影响HIE的发展和患儿的预后[14]。PAGACZ等[15]报道，当脑组织缺氧后有23种miRNA表达上调、32种miRNA表达下调。miR-30b和miR-199a均是与大脑神经功能密切相关的miRNA。SONG等[16]研究指出，miR-30b可以通过调控多种蛋白和信号通路影响大脑突触功能，进而影响阿尔茨海默病患者的认知功能，并在大脑神经退行性病变的发生、发展中起到重要作用。miR-199a与大脑神经功能及组织缺氧有密切关系。TIAN等[17]报道，miR-199a具有促进血管内皮新生的功能。LE等[18]研究指出，miR-199a下降可以引起血管内皮功能失调，并导致血流供应障碍。SUN等[19]报道，当组织发生缺氧时，miR-199a表达水平显著降低，引起组织中缺氧诱导因子水平升高。本研究结果发现，HIE患儿血清miR-30b、miR-199a低表达，并与HIE的病情密切相关，病情越重，患儿血清miR-30b、miR-199a表达水平越低，推测当发生HIE时，脑组织缺氧缺血，导致miR-30b、miR-199a水平降低。miR-30b可以通过调控信号通路影响与神经功能相关的蛋白，加重神经元损伤，而miR-199a则可能通过引起血管内皮功能失调，引起脑组织血流供应障碍，加重患儿脑组织损伤。
本研究结果还发现，HIE患儿的NSE、S100B、SEM3A、PAI-1水平高于对照组；
趋势检验显示病情越重，HIE患儿的NSE、S100B、SEM3A、PAI-1水平越高。NSE主要存在于神经细胞的胞质内及神经内分泌组织中，与神经系统的增殖、分化和代谢有密切关系[20]。S100B是一类特异性钙结合蛋白，主要存在于中枢神经系统垂体前叶细胞和星形胶质细胞中[21]。当发生HIE时，神经细胞发生缺氧损伤，血清内NSE、S100B水平升高[22]。SEM3A是一种以半胱氨酸富集区域为特征的分泌型蛋白，具有调控神经轴突生长、发育的功能[23]。PAI-1是一种促进血栓形成的因子，与心脑血管疾病的发生有密切关系[24]。笔者推测，当发生HIE时，脑血管发生缺血缺氧，PAI-1水平升高，并进一步引起脑血管内皮损伤，促进微血栓形成[25]。而HIE患儿SEM3A水平升高可能是一种代偿性升高，表明此时神经元受到损伤。通过NBNA评分可以了解新生儿行为能力，并能早期发现颅脑损伤。NBNA评分由20项内容组成，评分越低表明神经功能受损越严重[26]。本研究HIE患儿NBNA评分低于对照组，趋势检验显示病情越重，HIE患儿NBNA评分越低，表明患儿神经功能受损也逐渐加重。
KHANDELWAL等[27]研究报道SEM3A是miR-30b的调控靶基因。而LUCA等[28]报道PAI-1是miR-199a的调控靶基因。本研究中，HIE患儿血清miR-30b表达与SEM3A水平呈负相关，也提示miR-30b水平降低后可能导致其对SEM3A的抑制作用降低，导致SEM3A水平升高。miR-199a表达与血清PAI-1水平呈负相关，则提示miR-199a水平降低后可能导致其对PAI-1抑制作用降低，PAI-1水平升高，促进血栓形成从而促进HIE的发展。另外，HIE患儿血清miR-30b表达与NSE、S100B、PAI-1水平呈负相关，与NBNA评分呈正相关；
血清miR-199a表达与NSE、S100B、SEM3A水平呈负相关，与NBNA评分呈正相关。这也提示miR-30b、miR-199a、NSE、S100B、SEM3A、PAI-1可能共同参与了HIE的发生和发展，其具体机制仍有待于今后深入研究。
本研究多因素分析得出：NSE≥35 g/L、S100B≥100 ng/L、SEM3A≥45 ng/mL、PAI-1≥100 pg/mL是HIE患儿预后不良的危险因素(P<0.05)，miR-30b≥0.85、miR-199a≥1.25、NBNA评分≥32分则是HIE患儿预后不良的保护因素(P<0.05)，提示通过对HIE患儿血清miR-30b、miR-199a表达水平进行观测，可以为HIE患儿的预后评估提供一定依据。
综上所述，本研究发现，HIE患儿血清miR-30b、miR-199a表达水平异常降低，且患儿神经损伤程度越严重其表达水平越低。miR-30b、miR-199a、NSE、S100B、SEM3A、PAI-1可能共同参与了HIE的发生和发展。血清miR-30b、miR-199a的表达水平对HIE的诊断和预后判断具有一定参考价值。
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