董蕾，史天云
（南阳市第一人民医院妇科，南阳 473200）
多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育龄期女性较为常见的内分泌疾病，是导致生育率降低的原因之一[1]。PCOS 患者中与卵泡分化和排卵密切相关的颗粒细胞（granular cells，GC）表现出异常增殖或凋亡[2]。最近研究显示，改善GC 的病理改变可有效缓解PCOS 症状[3]。miRNA 是非编码的小单链RNA 分子，长度为18～24 个核苷酸，通过靶向信使RNA 的3"-非翻译区表达可调节基因，被视为不同疾病的独立生物标志物或治疗靶点[4-5]。miRNA在生殖系统疾病中的致病作用已引起广泛关注[6-7]，miR-132 位于人类17 号染色体非编码基因的内含子中，据报道在各种疾病中发挥不同的作用，如血管内皮炎症、妊娠期糖尿病和牙周炎[8-10]。Wu 等[11]研究显示，miR-132 可影响卵巢颗粒细胞中的雌二醇合成的作用机制。此外，已有研究显示miRNA 通过靶向SMAD4 在转化生长因子（TGF）-β1 刺激后在卵巢颗粒细胞中发挥重要的生物学作用[12]。而miR-132 是否可通过调节SMAD4 在PCOS 中发挥一定作用，目前还不明确。本文旨在分析miR-132 和SMAD4 在PCOS 的表达水平，以及对卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡的影响，并进一步验证二者是否存在靶向关系。
1.1 研究对象 收集2019 年5 月—2021 年3 月接受治疗的PCOS 患者85 例，年龄21～35 岁，纳入患者的诊断符合《PCOS 中国诊疗指南》[13]，排除高雄激素血症、库欣综合征、非经典型先天性肾上腺皮质增生、卵巢或肾上腺分泌雄激素的肿瘤、功能性下丘脑性闭经、甲状腺疾病、高泌乳血症和早发性卵巢功能不全等。另收集同时期来院就诊的月经规律的健康女性40 名作为对照组，年龄23～36 岁。本研究经医院伦理委员会批准（批准文号：20192154），患者知情同意。
1.2 材料 人卵巢颗粒细胞KGN 购于ATCC 细胞库，血液RNA 分离试剂盒购于赛默飞世尔科技，Trizol 试剂购于北京索莱宝科技有限公司，TaqMan miRNA 逆转录试剂盒购于赛默飞世尔科技，SYBR Premix Ex Taq ⅡTM PCR 试剂盒购于宝生物工程（大连）有限公司，si-NC（敲低miR-132 对照质粒）、si-miR-132（敲低miR-132 质粒）、miR-NC（SMAD4模拟物对照质粒）、SMAD4 mimic（SMAD4 模拟物）和SMAD4 相关荧光素酶质粒（野生型WT、突变型MT）均由元生物技术（上海）股份有限公司合成，Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒和双萤光素酶报告基因检测试剂盒（RG027）购于碧云天生物技术有限公司。
1.3 外周血中指标的检测 抽取患者经期第2～5天时的空腹肘静脉血5 mL，放置4 ℃离心机中以3 000 r/min 的速度离心15 min，将上清移至EP管中，放置-80 ℃冰箱中保存。全自动生化分析仪检测黄体生成素（LH）、睾酮（T）、雄烯二酮和卵泡刺激素（FSH）的水平。
1.4 qRT-PCR检测不同组间miR-132、SMAD4 mRNA 相对表达水平 血液RNA 分离试剂盒提取对照组和PCOS 组外周血中总RNA，使用Trizol试剂提取KGN 细胞中总RNA。利用NanoDrop 2000分光光度计检测RNA 的浓度和纯度。TaqMan miRNA 逆转录试剂盒将RNA 逆转为cDNA。反应条件：37℃15 min 设置3 个循环，85℃5 s。以cDNA为模板，按SYBR Premix Ex Taq ⅡTM 实时荧光定量PCR 试剂盒说明进行PCR 扩增。U6 的上游引物序列5"-GCTCCGCACGCAGGAG-3"，下游引物序列为5"-CTACACGGGCGGACGT-3"，GAPDH 的上游引物序列5"-CATGGAGACGGCCAGCGTC-3"，下游引物：5"-GTAGTCCGTGGTGAGATATC-3"，miR-132的上游引物：5"-CTGGTAGGGTACAGTACTGTGATA-3"，下游引物：5"-ATCGTGACCTGTAGGCCG-3"。SMAD4 上游引物：5"-GACGGAGACGCTGGTGATAGCGTC-3"，下游引物：5"-CGGCAGTTATACCGCCAAGTCAACG-3"。PCR 扩增体系共25 μL（模板DNA 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Taq DNA 聚合酶0.25 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，ddH2O 17.25 μL）。反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s 共40 个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量，SMAD4 mRNA 相对表达水平以GAPDH 为内参，miR-132 相对表达水平以U6 为内参，见图1～3。
图1 引物测试中扩增曲线Fig 1 Amplification curve in primer test
图2 引物测试中溶解曲线Fig 2 Dissolution curve in primer test
图3 计算扩增效率时的标准曲线Fig 3 Standard curve for calculating amplification efficiency
1.5 转染实验 取传3 代，对数生长期、生长状态良好的KGN 细胞。每孔4×105万个细胞，接种于6孔板，置于37℃、5% CO2恒温箱中，培养24 h 后，随机分为si-NC 组、si-miR-132 组、miR-NC 组和SMAD4 mimic 组、SMAD4 mimic+miR-132 mimic组，按lipofectamine 2000 转染实际说明，分别转染si-NC质粒、si-miR-132质粒、miR-NC质粒、SMAD4 mimic 质粒和SMAD4 mimic+miR-132 mimic质粒。转染6 h 后，更换新的培养基，继续培养48 h，收集各组细胞，利用qRT-PCR 技术检测转染效果。
1.6 MTT 实验检测细胞增殖 收集经转染处理48 h后si-NC 组、si-miR-132 组、miR-NC 组和SMAD4 mimic 组、SMAD4 mimic+miR-132 mimic 组的细胞，按照5×103个/孔的密度种于96 孔板，每组设6 个复孔。放置37℃、5%CO2恒温箱中培养72 h，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，放置恒温箱中继续孵育4 h。弃上清液，每孔加入DMSO 150 μL，充分混匀，使结晶物充分溶解。酶标仪于570 nm 波长处检测各孔的吸光度值，并计算细胞的增殖率。
1.7 流式细胞术检测细胞凋亡率 收集经转染处理48 h 后si-NC 组、si-miR-132 组、miR-NC 组和SMAD4 mimic 组、SMAD4 mimic+miR-132 mimic组的细胞，以每孔3×105个密度接种至6 孔板，于37℃、5% CO2恒温箱中孵育48 h。收集细胞于1.5 mL 的EP 管中，放置离心机中以1 000 r/min 的速度，离心5 min，去上清。每管加入Annexin V-FITC结合液500 μL 重悬细胞，然后加入Annexin VFITC 5 μL、PI 10 μL，轻轻混匀，室温避光孵育10 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.8 miR-132 靶向调控SMAD4 的验证 以KGN细胞的cDNA 为模板，通过PCR 扩增，获取野生型和突变型序列，连接到野生型SMAD4 3"UTR 和点突变型SMAD4 3"UTR。将KGN 细胞接种于12 孔板中，随机分为SMAD4 WT 组、SMAD4 WT+miR-132mimic 组、SMAD4 MUT 组、SMAD4 MUT+miR-132 mimic 组，进行常规培养当细胞融合至80%时，分别转染SMAD4 WT 质粒、SMAD4 WT 质粒和miR-132 mimic 质粒、SMAD41 MUT 质粒、SMAD4 MUT 质粒和miR-132mimic 质粒。转染48 h，收集细胞，按双荧光素酶活性检测试剂盒说明检测各组萤光素酶活性。
1.9 统计学处理 应用SPSS21.0 软件行统计分析，计量资料均符合正态分布，采用表示，两组间比较采用独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 两组间一般临床资料和miR-132、SMAD4 水平的比较 两组间年龄和BMI 比较无统计学差异，PCOS 组LH、T、雄烯二酮和miR-132 相对表达水平高于对照组，FSH 和SMAD4 mRNA 相对表达水平低于对照组，组间比较差异均有统计学（P＜0.05），见表1 和表2。PCOS 组miR-132 和SMAD4 mRNA 的相对表达水平经Pearson 相关性分析结果显示，两者呈负相关（r=-0.876，P＜0.001）。
表1 两组间一般临床资料、LH、T 和FSH 水平的比较（）Tab 1 Comparison of general clinical data，LH，T and FSH levels between the two groups（）
表1 两组间一般临床资料、LH、T 和FSH 水平的比较（）Tab 1 Comparison of general clinical data，LH，T and FSH levels between the two groups（）
注：BMI：体重指数；
LH：黄体生成激素；
T：睾酮；
FSH：卵泡刺激素；
PCOS：多囊卵巢综合征
表2 两组间雄烯二酮、miR-132 和SMAD4 水平的比较（）Tab 2 Comparison of androstenedione,miR-132 and SMAD4 levels between the two groups（）
表2 两组间雄烯二酮、miR-132 和SMAD4 水平的比较（）Tab 2 Comparison of androstenedione,miR-132 and SMAD4 levels between the two groups（）
注：miR-132：微小RNA132；
SMAD4：人母亲DPP 同源物4；
PCOS：多囊卵巢综合征
2.2 miR-132 逆转SMAD4 对KGN 细胞增殖和凋亡影响 si-miR-132 组中miR-132 相对表达水平为0.58±0.07，低于si-NC 组（2.68±0.24，t=5.201，P＜0.001）。SMAD4 mimic 组SMAD4 mRNA 水平为1.89±0.21，高于miR-NC 组（0.82±0.10）和SMAD4 mimic+miR-132 mimic 组（0.63±0.08，t=3.251、4.012，P＜0.05）。simiR-132 组细胞增殖率低于si-NC 组（t=8.512，P ＜0.001），细胞凋亡率高于si-NC 组（t=7.625，P＜0.001）。SMAD4 mimic 组细胞增殖率低于miR-NC组和SMAD4 mimic+miR-132 mimic 组（t=3.210、3.515，P＜0.05），细胞凋亡率高于miR-NC 组和SMAD4 mimic+miR-132 mimic 组（t=9.415、10.320，P＜0.001），见表3。
表3 miR-132 逆转SMAD4 对KGN 细胞增殖和凋亡影响（）Tab 3 The effect of miR-132 reversal of SMAD4 on the proliferation and apoptosis of KGN cells（）
表3 miR-132 逆转SMAD4 对KGN 细胞增殖和凋亡影响（）Tab 3 The effect of miR-132 reversal of SMAD4 on the proliferation and apoptosis of KGN cells（）
2.3 miR-132 靶向调节SMAD4 miR-132 与SMAD4 存在靶向结合位点，见图4。SMAD4 WT+miR-132 mimic 组荧光素酶活性低于其他3 组（t=3.015、3.521、3.628，均P＜0.05），其他3 组间荧光素酶活性比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表4。
图4 miR-132 靶向调节SMAD4Fig 4 miR-132 targeted regulation of SMAD4
表4 组间荧光素酶活性的比较（）Tab 4 Comparison of luciferase activity between groups（）
表4 组间荧光素酶活性的比较（）Tab 4 Comparison of luciferase activity between groups（）
注:WT:野生型；
MUT：突变型
GC 的异常增殖和卵泡停滞与PCOS 的发展有关，KGN 细胞系是一种有效的颗粒细胞模型，保留了GC 的正常生理特点，已成功应用于探索GC 在多种疾病中的生物功能和分子机制。在本研究中，首先检测到PCOS 组外周血中miR-132 相对表达水平高于对照组，SMAD4 mRNA 相对表达水平低于对照组。推断miR-132 的过表达和SMAD4 的低表达可能与PCOS 的发病机制有关。
研究显示，miR-132 在不同器官中均发挥作用[14-16]，亦有研究显示在PCOS 中表达异常[17]，但对GC 的调节作用还不明确。KGN 细胞已被广泛用于研究GC 的细胞生长和凋亡，既往研究也有发现，miRNA 的调控可影响KGN 细胞的增殖和凋亡，与PCOS 发病有关[18]。同样，本研究证实miR-132 表达的下调可抑制KGN 细胞的增殖并促进其凋亡，说明miR-132 可能通过抑制KGN 细胞增殖和促进细胞凋亡，参与PCOS 的发病机制。据本研究发现，miR-132 可以调节SMAD4 参与PCOS 的发展。通过构建SMAD4 过表达的KGN 细胞后发现，SMAD4过表达可明显抑制KGN 细胞增殖并促进凋亡，然而构建miR-132 和SMAD4 均过表达的KGN 细胞后发现，与SMAD4 mimic 组相比过表达SNAD4 mimic+miR-132 mimic 组细胞增殖率增加，凋亡率降低，说明miR-132 可逆转SMAD4 抑制KGN 细胞增殖的作用。进一步由双萤光素酶活性检测试验显示，miR-132 可直接靶向结合SMAD4 mRNA 基因序列，形成RNA 诱导沉默复合体，达到抑制翻译的目的，从而降低SMAD4 蛋白的表达，解释了miR-132 逆转SMAD4 抑制KGN 细胞增殖的作用。
综上所述，本研究报道了PCOS 患者外周血中miR-132 表达水平的异常升高，SMAD4 表达水平降低。体外实验证实，miR-132 可促进人颗粒状细胞增殖并抑制凋亡，SMAD4 可抑制人颗粒细胞增殖并促进凋亡。分子机制的进一步探索表明，miR-132可靶向调节SMAD4 的表达。通过评估miR-132 和SMAD4 在PCOS 中的生物学功能，便于更好的理解miRNA 在PCOS 发生和发展中的作用，为PCOS 的治疗提供新的方向。
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