肖剑伟，蔡旭，郭粉莲，尹志华，陈新鹏，叶志中
深圳市福田区风湿病专科医院，广东 深圳 518000
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)已成为影响全球0.5%～1.0%人口的常见病之一[1]。作为一种慢性自身免疫性疾病，RA滑膜组织内细胞的死亡刺激可导致炎症进一步加重，加快疾病进程。脂质过氧化诱发的铁死亡是新近发现的一种非凋亡的细胞死亡方式，近十年来得到了广泛的研究[2]。大量研究显示，铁死亡在多种疾病的发生发展过程中发挥着重要作用，如癌症、神经系统疾病等[3-4]。淫羊藿苷能够通过系统Xc-/谷胱甘肽过氧化物酶4(system Xc-/glutathione peroxidase 4，Xc-/GPX4) 轴抑制铁死亡，从而增强脂多糖诱导的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞活力[5]，提示铁死亡在RA的发病中发挥着重要作用，调控铁死亡过程成为一个新的治疗RA的潜在靶点。
目前，常见的治疗RA的药物包括非甾体类、抗风湿病药物、生物制剂等，虽然效果明显，但不良反应也日益凸显。随着中药在疾病中的应用越来越受到重视，从中药中挖掘潜在的分子用来治疗疾病已成为当前研究的热点之一。二妙散是中医药治疗痹症的经典方剂，由苍术和黄柏组成，具有治疗湿热下注、筋骨疼痛之作用。研究显示，二妙散对RA患者具有明显疗效[6]，然而其作用机制尚不明确。本研究以加权基因共表达网络(weighted gene co-expression network，WGCNA)分析为基础，结合分子对接、分子动力学技术探索二妙散通过影响铁死亡治疗RA的作用机制。
1.1 数据材料以“ rheumatoid arthritis”为关键词，在GEO数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中检索下载数据集。见表1。
表1 基因表达数据谱
1.2 加权基因共表达网络分析选取方差>50%的基因，在R软件中使用“WGCNA”包[7]进行分析。选择合适的软阈值(β)，将系统聚类树(MEDissThres)设置为0.25以合并相似的模块。将矩阵数据转化为邻接矩阵并基于拓扑重叠进行聚类，设置模块至少含50个基因。将GSE77298数据集设置为正常组及RA组，构建临床信息并计算基因显著性。选择相关性最大的模块中的基因，通过string网站进行基因本体(gene oncology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信号通路富集分析。
1.3 二妙散活性成分筛选及作用靶点预测在中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)[8]检索二妙散组方中药黄柏、苍术的化学成分，设定口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18，筛选得到活性成分及其作用靶点，使用Cytoscape软件绘制“二妙散-活性成分-活性成分靶点”网络图。
1.4 铁死亡相关靶点及二妙散调控铁死亡治疗RA的潜在靶点获取通过FerrDb数据库[9]获取铁死亡相关基因。将结果与1.2中与临床相关性最强的模块基因及二妙散活性成分靶点进行映射取交集，获得二妙散调控铁死亡治疗RA的潜在靶点。
1.5 治疗靶点多数据集验证分别在GSE55235和GSE55457数据集中，通过t检验分析二妙散调控铁死亡治疗RA的潜在靶点在正常组及RA组滑膜组织中的表达情况。
1.6 分子对接在RCSB PDB(www.rcsb.org/)获取靶点的晶体结构，采用Pymol[10]去除晶体水后使用AutoDock对蛋白进行加氢及电荷。从Pubchem获取活性小分子成分结构，使用ChemBio3D进行能量最小化。使用AutoDock Vina进行半柔性分子对接并选取结合能最小的复合物体系作为最佳配体。使用ligplot+计算和绘制复合物的氢键和疏水键。
1.7 分子动力学分子动力学模拟使用Gromacs 2020.3软件进行[11]。在ATB网站[12]上传化合物小分子结构，将其转换为Gro格式并生成位置限制文件。使用Gromacs内置pdb2gmx命令分别生成靶蛋白坐标文件及拓扑文件。将小分子及蛋白的Gro格式合并为复合物的Gro文件。力场选用Gromos54a7_atb，水分子模型选用SPC，创建大小为 1.0 nm 的十二面体水盒子。根据计算结果加入钠离子中和电荷，使模拟系统总电荷为0 C。将动力学模拟体系的温度设定为300 K。采用最速下降法优化后进行NVT和NPT 系综平衡，最后进行总时长为20 ns的动力学模拟，步长设定为2fs。去除体系的周期性边界并提取20 ns时的最终复合物构象。使用VMD[13]、Pymol进行可视化处理，计算复合物的均方根偏差(root mean squared deviation，RMSD)、溶剂可及表面(solvent accessible surface area，SASA)、蛋白回旋半径(gyrate，GR)，并通过Gromacs插件 g_mmpbsa计算结合自由能[14]，通过拉氏图评估动力学模拟后蛋白结构的合理性。
2.1 WGCNA结果GSE77298数据集共涉及 10 827 个基因纳入网络的构建。β值一般选择在平均连接度变化呈平稳处，值在16以下，且R方要高于0.8，本研究选择β=12作为软阈值，见图1，图中纵轴代表对应网络log(k)与log(p(k))相关系数的平方，相关系数的平方越高，说明该网络越逼近无网络尺度的分布；
红线处对应的上方的β值为本次最合适的β值，这意味着特征基因相关性高于0.9的模块将被合并。因而选择基于拓扑重叠以及分配的模块颜色，对具有相似性基因的树状图进行聚类，并对基因相关性高于0.9的模块进行合并，见图2，每个彩色行代表一个颜色编码的模块，其包含一组高度相关的基因，共确定12个模块。对各模块进行临床信息相关性研究发现，黄色模块的相关性为+0.57和-0.57，其中正值表示正相关，负值表示负相关，且黄色模块的P值为0.004，即黄色模块相关性最大且P值最小，见图3及图4，因而选取黄色模块进一步进行GO功能富集分析及KEGG信号通路相关分析，见图5，该黄色模块共含有744个基因，GO功能富集分析发现92条分子功能、732条生物学过程及130条细胞成分，其中分子功能(molecular function，MF)涉及肿瘤坏死因子受体超家族结合等，生物学过程(biological process，BP)涉及免疫系统过程等，细胞成分(cellular component，CC)主要定位于囊泡等。KEGG信号通路富集分析发现75条信号通路，主要涉及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)信号通路、核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信号通路等，与RA疾病的发生发展密切相关。
图1 确定软阈值图
图2 聚类分析合并后得到的模块
注：每个方块中上面的数字表示相关性(红色方块为正值表示正相关，绿色方块为负值表示负相关)，下面括号中数字代表P值图3 各模块与RA的相关性
图4 黄色模块各基因与临床性状相关性
注：5A：GO富集分析气泡图；
5B：KEGG信号通路富集分析气泡图图5 GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析气泡图
2.2 二妙散活性成分及其相关靶点基于TCMSP筛选得到苍术和黄柏有效活性成分分别为9个和37个，两者共同作用靶蛋白103个，将苍术、黄柏有效活性成分及相关靶点导入Cytoscape软件绘制“二妙散-活性成分-活性成分靶点”网络图，见图6。
注：橘红色表示药物；
绿色表示有效活性成分；
紫色表示靶点图6 “二妙散-活性成分-活性成分靶点”网络图
2.3 二妙散调控铁死亡治疗RA的相关靶点通过FerrDb数据库获得铁死亡相关基因97个，与WGCNA分析中黄色模块包含的744个基因及103个二妙散活性成分相关靶点取交集，得到二妙散调控铁死亡治疗RA的相关靶点1个，即花生四烯5-脂氧合酶(arachidonate 5-lipoxygenase，ALOX5)。见图7。
图7 二妙散调控铁死亡治疗RA的潜在靶点的韦恩图
2.4 多数据集验证ALOX5表达结果在GSE55235与GSE55457数据集中分析ALOX5蛋白的表达量，结果显示，与正常组比较，不同数据集的RA组滑膜组织中ALOX5蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)，见图8。
图8 滑膜组织中ALOX5蛋白的差异表达情况
2.5 分子对接结果黄柏、苍术的有效活性成分中，槲皮素、汉黄芩素共同作用的靶点为ALOX5，因而，选择槲皮素及汉黄芩素与ALOX5进行分子对接。结果显示，槲皮素、汉黄芩素均能够与ALOX5形成多个氢键及疏水键，其中槲皮素与ALOX5的对接结合能为-9.4 kcal·mol-1，与Leu448、Gln549、Ala453、Ser447、Phe450、Arg457、Tyr470、Val243、Ile365、Thr366形成疏水作用；
汉黄芩素与ALOX5的对接结合能为-9.1 kcal·mol-1，与Ile167、Arg401、Glu622、Asp166、Try100、His624、Phe393、Arg101形成疏水作用。见图9。
图9 分子对接示意图
2.6 分子动力学结果槲皮素-ALOX5及汉黄芩素-ALOX5 2个复合体系在长达20 ns的整个模拟过程中，RMSD波动小于0.2 nm并且在5 ns时达到平衡状态，见图10。复合物体系的GR越小，提示复合物在水溶液中的结构越稳定，见图11。SASA结果显示，随着时间延长，2个复合物体系的SASA逐渐缩小，提示其随着时间延长而逐渐趋于稳定，见图12。与模拟前对比，经过20 ns的动力学模拟后，汉黄芩素、槲皮素依然与ALOX5紧密结合。汉黄芩素与ALOX5结合后，小分子在活性口袋内部移动变化幅度较大且其Gyrate变化较明显，考虑可能为活性小分子使蛋白质的三级结构发生改变，抑制了靶蛋白的活性，见图13。拉氏图显示，与槲皮素和汉黄芩素结合后，ALOX5蛋白99.7%和99.8%的氨基酸残基均处在合理范围内，提示模拟后的蛋白结构是可靠而且合理的，见图14。结合自由能结果显示，槲皮素与ALOX5之间主要通过范德华力、静电势能结合；
汉黄芩素与ALOX5主要通过范德华力结合；
极性溶剂化作用则抑制槲皮素、汉黄芩素与ALOX5的结合，见表2。
图10 小分子蛋白复合物体系的RMSD
图11 小分子蛋白复合物体系的蛋白回旋半径
表2 槲皮素、汉黄芩素与ALOX5的结合自由能
表2 槲皮素、汉黄芩素与ALOX5的结合自由能
化合物受体蛋白范德华力静电势能极性溶剂化作用表面溶剂化作用结合自由能槲皮素ALXO5-113.91±13.71-139.82±19.95134.90±15.06-16.26±0.86-135.10±16.46汉黄芩素ALXO5-130.81±10.68-17.23±9.5055.59±20.67-16.20±1.01-108.66±21.53
图12 小分子蛋白复合物体系的溶剂可及表面
图13 分子动力学模拟示意图
图14 分子动力学模拟后ALOX5蛋白拉氏图
RA是最常见的慢性炎症性疾病，反复的炎症反应会导致滑膜增厚，并引起关节肿胀[15]，越早启动治疗，其症状缓解的可能性就越大[16]。炎症通常是由有害刺激引发的，包括感染、细胞死亡和组织损伤等[17]。细胞凋亡和坏死是细胞死亡的主要形式，而铁死亡是一种依赖于铁和脂毒性的非caspase依赖性细胞死亡形式[18]，它是由非酶促(fenton)反应和脂氧合酶(lipoxygenase，LOXs)引发，并由铁催化脂质过氧化反应[19]。细胞死亡常伴随着炎症反应，而在炎症发生的过程中，花生四烯酸作为细胞膜脂质的主要成分，通过3条代谢途径代谢为生物活性促炎介质前体，其中一条为LOXs途径，LOXs转化为白三烯和脂氧素参与炎症反应[20]。LOXs家族成员之一ALOX5是触发脂质过氧化的关键酶[21]。研究表明，ALOX5抑制剂Zileuton通过抑制谷氨酸诱导的HT22细胞铁死亡起到神经保护作用[22]。在脂肪性肝炎小鼠模型中，铁死亡抑制剂罗格列酮和去铁螯合剂去铁酮能够改善肝细胞死亡并抑制炎症因子的表达[23]。综上可见，铁死亡可能是炎症的启动因素，或者至少具有促炎作用，抑制铁死亡可以抑制炎症反应。最近的研究发现，许多铁死亡抑制剂(包括Fer-1、liproxstatin-1和LOXs抑制剂)可防止在铁死亡期间fenton反应驱动的多不饱和脂肪酸的自氧化和非酶促反应的破坏[24-25]。本研究发现，在RA滑膜组织中ALOX5蛋白表达水平明显升高，由此推测ALOX5可能导致滑膜组织铁死亡增加，导致炎症进一步加重，因此抑制滑膜组织的铁死亡，可能能够减轻炎症，改善RA患者症状。
在RA疾病活动期，患者以多关节疼痛为主要临床表现，中医认为邪气盛则实，其肿、热属于“邪实”的表现，导致滑膜循环血流淤滞，实验室检查可见炎症指标明显升高，推测局部血管循环的变化是RA的基本病理因素之一；
同时，炎症过程中产生的各种炎症介质、自身抗体等可作为毒邪入侵而影响气血运行，导致脉络淤滞。上述这类变化与中医的“瘀”一致，故中医治疗RA以攻邪为主，扶正为辅，给予行瘀、清热、除湿之法，与西医的抗炎治疗具有相同的含义。二妙散治疗RA已取得了明确的疗效，可减少IL-1β分泌，对炎症产生抑制作用[26-27]，提示二妙散能够通过减轻炎症反应改善RA患者的症状。而本研究亦显示，二妙散可能通过影响铁死亡来抑制炎症反应，以上研究结果与二妙散清热燥湿化瘀之功效具有异曲同工之处。
本研究结果显示，汉黄芩素、槲皮素与ALOX5之间的结合自由能较低，经过动力学模拟后仍与ALOX5紧密结合。研究显示，汉黄芩素通过抑制ALOX5减少乳腺癌细胞的侵袭和炎症[28]。虎杖提取物之一槲皮素能够抑制肿瘤细胞中ALOX5的活性[29]。张良等研究显示，槲皮素能够通过抑制前列腺组织内ALOX5表达改善自身免疫性慢性前列腺炎[30]。根据以上研究推测，汉黄芩素、槲皮素均能使ALOX5活性降低，从而减少铁死亡，减轻炎症反应。二妙散中黄柏苦寒清除湿热，为治下焦湿热之要药；
苍术苦温辛燥，两者配伍能够寒温协调，阴阳相济，从而达到清热燥湿，标本兼顾的治疗效果。而槲皮素作为黄柏的主要成分，与ALOX5具有较低的结合自由能，在治疗中发挥着更大的作用，这与二妙散中黄柏作为主药是相符合的。二妙散为复方中药汤剂，在治疗中具有多组分、多靶点、多途径的特点，不同的成分也可作用于同一靶点，发挥协同作用。本研究从铁死亡角度阐述了二妙散可能通过影响滑膜组织中ALOX5的活性，减少铁死亡，进而降低滑膜中的炎症反应，为进一步验证和开发提取中药有效成分治疗RA提供了理论依据。
综上，基于加权基因共表达网络分析和分子动力学探讨发现二妙散可通过调控滑膜组织中ALOX5的活性减少铁死亡进而改善类风湿关节炎。然而，本研究结果需要进一步通过使用体内外实验检测来验证。
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