孙 见
（1.威海海洋职业学院，荣成 264300；
2.中国农业科学院特产研究所，长春 132109）
猪繁殖与呼吸障碍综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一种以怀孕母猪繁殖障碍、流产、木乃伊胎和呼吸困难为主要特征的疾病，高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征在我国已被列为一类动物疫病，给养猪业造成了巨大的经济损失。弱毒疫苗的应用在一定程度上控制了本病的流行，但由于病毒的不断变异，给防控工作带来了巨大的挑战[1-2]。建立针对PRRSV抗体检测的间接ELISA检测方法，对于疫苗效力评价、种群进化均有重要意义。N蛋白在病毒粒子中含量最高，且免疫原性较强，在对PRRSV抗体监测中最早7即可监测到N蛋白抗体并且持续存在半年之久[3-4]。因此，N蛋白可作为PRRSV抗体的检测抗原，在对PRRSV抗体持续监测中都有重要的诊断学意义[5]。本研究以化学合成的方法合成了三条针对N蛋白的多肽，从中筛选了一条最适多肽建立的间接ELISA方法，通过与商品化IDEXX-PRRSV-X3试剂盒的比较，其特异性和敏感性均较高，此方法的建立对猪群的种群净化具有重要意义。
1.1 标准阳性血清及阴性血清 PRRSV阳性血清，用PRRSV 弱毒疫苗免疫16头25日龄PRRS阴性猪一个月左右采集血清；
PRRSV阴性血清50份，来自SPF猪场；
猪伪狂犬、猪圆环、猪瘟、猪细小病毒阳性血清均由本实验室保存。
1.2 主要试剂、耗材、设备 TMB、辣根过氧化酶（HRP）标记的兔抗猪二抗购自Sigma，96孔可拆卸酶标板购自美国Costar公司，酶标仪为Bio-Rad公司产品，PRRSV抗体检测试剂盒为美国IDEXX公司产品。
1.3 N蛋白抗原表位预测 主要涉及以下几个参数：①亲水性参数；
②可及性参数；
③极性参数；
④柔韧性参数；
⑤抗原性参数。采用DNA star预测软件和在线预测（http://.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）相结合的方式对上述参数进行预测。
1.4 合成多肽的筛选 对已经合成的三条抗原表位多肽采用间接ELISA方法分别与PRRSV阴阳性血清（经IDEXX鉴定）进行反应测定抗原表位多肽的反应性和特异性。将合成的三条多肽分别进行2000倍稀释包被酶标板，4℃过夜，甩干洗涤三次，加入100倍稀释的PRRSV阴阳性血清100 μL/孔，37℃反应 45 min，甩干洗涤三次，加入HRP标记兔抗猪酶标二抗100 μL/孔，37℃作用 45 min，甩干洗涤三次，加入TMB显色液100 μL/孔，37℃避光显色 15 min，加入2 mol/L H2SO450 μL/孔终止反应，A（450 nm）读数。
1.5 多肽工作浓度和血清最佳稀释倍数的选择 采用方阵滴定法测定多肽最佳包被量和血清最佳稀释度。多肽稀释至终浓度为0.3125、0.625、1.25、2.5、5.0和10.0 μg/mL，阴阳性血清分别稀释至1∶50、1∶100、1∶200、1∶400，之后按常规方法进行试验，以P/N值最大时的多肽含量和血清稀释倍数作为最佳多肽工作浓度和血清稀释倍数。
1.6 其他试验条件的优化 在多肽工作浓度和血清稀释倍数确定的基础上,分别进行多肽包被条件、封闭液、酶标二抗工作浓度、血清、酶标二抗、显色液作用时间等优化试验，各项试验均按常规方法设计。按P/N值最大，且阴性血清OD值较低的原则确定最佳作用条件。
1.7 PRRSV多肽间接ELISA检测方法的建立 依据上述试验所确定的最适条件，建立PRRSV多肽间接ELISA方法。
1.8 判定标准的建立 选取经IDEXX试剂盒鉴定的阴性血清50份，用已优化好的间接ELISA方法进行检测，计算S/P值，结果进行统计学分析。
1.9 灵敏度试验 利用已优化好的的最佳条件，将PRRSV标准阳性血清以1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400稀释测定OD值，计算S/P值，最大稀释倍数仍为阳性即为该检测方法的灵敏度。
1.10 特异性试验 分别取猪瘟、猪流感、猪伪狂犬、猪圆环病毒的阳性血清，1∶200倍稀释，用已优化的ELISA方法进行检测，每份血清重复检测3孔，同时设立阴阳性对照各1孔，以此来进行交叉性检测。
1.11 符合率试验 选取PRRSV阳性血清20份，分别进行102、103、104稀释，利用Pep3-PRRSV ELISA和IDEXX-PRRSV ELISA进行测定，计算符合率。
1.12 疫苗免疫后抗体动态监测 用PRRSV弱毒疫苗免疫5头PRRSV阴性猪，分别于第0、7、14、21～56 d采血分离血清测其抗体效价，并与IDEXX-PRRSV ELISA试剂盒的检测结果进行比对。
1.13 临床样品的检测 对采自湖南的200份血清，按照已建立的间接ELISA方法进行检测。
2.1 PRRSV N蛋白抗原表位预测结果 将各种预测方法预测的可能性抗原表位的肽段加以综合，选出了三段B细胞抗原性表位最可能出现的区域（表1）。通过对多肽的亲水性参数、可及性参数、极性参数、柔韧性参数综合分析最终得出，Pep3抗原性指数最强，且通过对经典毒株和高致病性毒株进行综合比对，该段序列保守性较高，适合作为优选多肽进行包被。
表1 B细胞表位预测结果Table 1 Prediction results of B cell epitope
2.2 最佳B细胞表位多肽的筛选 根据OD值可以看出（表2），多肽1、2尽管与阳性血清反应的OD值较高，但是与阴性血清反应的OD值也较高；
多肽3虽然与阳性血清反应的OD值较低，但是与阳性血清、阴性血清反应的P/N值最大，并且本底值很低，可以最大程度的消除本底值，易于对最后的结果判定做出正确的计算，所以综合分析应该选取多肽3为最佳的B细胞表位，并利用该多肽进行下面的试验。
表2 最佳多肽的选择Table 2 Selection of the optimal polypeptides
2.3 多肽最佳包被量和血清最佳稀释度的选择 当多肽工作浓度为2.5 μg/mL，一抗待检血清最佳稀释倍数为1∶200时当P/N值最大为6.147（表3）
表3 多肽包被量和一抗血清稀释度的确定Table 3 Determination of polypeptide-coated amounts and primary antibody serum dilution
2.4 最佳酶标二抗浓度的确定 酶标抗体1∶1000稀释时，检测的5份血清的P/N值显示最大（表4），之后随着酶标二抗稀释度的加大，P/N值也随之变小，所以酶标二抗选择1∶1000稀释。
表4 酶标二抗工作浓度的确定Table4 Determination of the working concentration of enzyme-labeled secondary antibodies
2.5 Pep3-PRRSV间接ELISA检测方法的建立 以2.5 μg/mL的合成肽（Pep3）包被酶标板，4℃过夜，不需封闭，阴阳性血清分别稀释200倍，37℃作用60 min，辣根过氧化酶（HRP）标记兔抗猪酶标二抗1000倍稀释，37℃作用30 min，TMB37℃显色15 min，2 mol/L H2SO4终止反应，酶标仪A（450 nm）读数。
2.6 临界值的确定 用已建立的间接ELISA方法检测50份阴性血清，计算S/P的平均值及标准差（表5）。S/P值=（样品的OD450值-阴性对照OD450）/（阳性对照OD450-阴性对照OD450），求得均值X为-0.012，标准差SD为0.112，因此当被检样品的S/P值≥S/P平均值（X）+3SD时，即S/P值≥0.324时，判为阳性；
X+3SD＞样品S/P值≥X+2SD时，即0.324＞样品S/P值＞0.212判为可疑；
当样品S/P值＜X+2SD，即S/P值≤0.212时，判为阴性。
表5 判定标准的建立Table5 Establishment of the determination criteria
2.7 灵敏度试验结果 PRRSV标准阳性血清1∶3200倍稀释时S/P值仍大于0.324（表6），说明该检测方法有较好灵敏度。
表6 灵敏性试验结果Table6 Results of the sensitivity test
2.8 特异性试验结果 对于猪瘟、猪圆环、猪伪狂犬、猪细小等4种疾病的阳性血清按间接ELISA程序测定，S/P值均小于0.224，为阴性（表7）。结果表明，Pep3-PRRSV间接ELISA诊断方法具有较高的特异性。
表7 特异性试验结果Table7 Results of the specific tests
2.9 符合率试验结果 选取经IDEXX和Pep3-ELISA检测均为阳性的血清20份，分别进行102、103、104稀释，结果显示（表8）：当血清进行100倍稀释时，二者的符合率为100%；
当被检血清稀释至104倍稀释时，符合率分别为89.9%和90%。
表8 符合率试验结果Table8 Results of the sensitivity test
2.10 PRRSV抗体的动态监测结果 PRRSV活疫苗免疫猪后，分别在第0、1、14、21-56 d采血分离血清，测其抗体效价（图1），经与IDEXX-PRRSVELISA试剂盒相比对，能比较正确的反应抗体的消长规律，所不同的是：IDEXX试剂盒能在疫苗免疫后7 d检测到PRRSV抗体，而Pep3-PRRSV ELISA检测方法能在疫苗免疫后14 d检测到PRRSV抗体，灵敏性稍差。
图1 PRRSV抗体动态消长规律Fig.1 Dynamic length extinction pattern of PRRSV antibodies
2.11 临床应用结果 IDEXX-PRRSV试剂盒检测出阳性样品128份，建立的Pep3-PRRSV ELISA方法检测出阳性血清117份，其中疑似样品20份，建立的诊断方法与标准检测试剂盒的符合率为91.4%（表9），说明建立的诊断方法与标准试剂盒的符合率较高；
对送检的湖南样品IDEXX检测阳性率为64%，Pep3-PRRSV ELISA检测阳性率为58.5%，说明该养殖场中PRRSV感染率较高。
表9 临床样品检测结果Table9 Test results of clinical samples
PRRSV是威胁养猪业的严重疫病之一，目前尚无特效的治疗药物，控制该病主要是使用PRRSV活疫苗[6]。因而建立新型的更为科学和便捷的诊断方法是当前有效防治PRRSV感染急需解决的问题[7]。ELISA技术具有操作简便、敏感性高和特异性强、重复性好、价格低廉等特点，在各实验室及基层单位已普遍应用[8]。传统的间接ELISA包被抗原主要分为全病毒和表达蛋白，以全病毒包被的优点是抗原制备方法比较简单，缺点是病毒的纯化比较复杂，血清、细胞碎片往往难以清除干净，而且存在散毒的危险；
表达蛋白又分原核表达和真核表达，原核表达大多以变性的包涵体形式存在，空间结构难以吻合，真核表达表达量低，后期的蛋白纯化也比较繁琐[9-12]。近年来，具有极大理论意义和应用价值的多肽的研究引起了学者的关注。合成肽方法与上述方法相比没有细胞等其他蛋白混杂,且相对分子质量小,结构简单,避免了与其他病毒细菌抗体交叉反应的可能,特异度更强,灵敏度更高,且多肤抗原是水溶性化合物,无感染性,可包被酶标板,使操作更省时、更方便以合成肽替代表达蛋白作为ELISA包被抗原，可以避免表达蛋白的纯化等复杂问题，显示出了它在免疫学等研究领域上的明显优势[13]。
本研究在PRRSV分子流行病学的基础上，依据病毒N蛋白在免疫学方面的特性[14]，利用化学合成的方法合成了针对PRRSV N蛋白的多肽，该多肽具有抗原性强、保守性高，比较稳定等特点可以作为包被抗原建立检测PRRSV抗体的间接ELISA方法，并对各项条件进行了优化，大大提高了检测的灵敏性和特异性，为PRRSV的快速诊断、预防和控制蔓延提供了依据。
本研究所建立的Pep3间接ELISA方法，与4种常见的猪病毒病均无交叉反应，说明特异性良好；
标准阳性血清稀释至3200倍时仍能检测到说明灵敏度较高；
与商品化的IDEXX试剂盒符合率为91.4%，且能很好的反应PRRSV抗体的动态消长规律，但抗体检出时间稍迟，或许因为该方法仅用了一条多肽进行包被而并未进行多肽的串联包被，所以前期灵敏性较IDEXX要差，后期试图寻求多肽的串联进行包被来提高检测的灵敏度。Pep3-PRRSV ELISA利用化学合成的方法合成抗原，大大降低了生产成本，跟IDEXX试剂盒相比，具有显著的价格优势，因而具有广阔的应用前景。