胡锦瑞，刘 欣，刁静静，王长远，
（1.黑龙江八一农垦大学 食品学院，黑龙江 大庆 163319；
2.黑龙江八一农垦大学 国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319）
绿豆含有丰富的蛋白质[1]、多糖[2]、多酚和生物碱[3]等活性物质，是一种具有营养价值的豆类作物。《本草纲目》中记载了绿豆具有清热解毒、消暑利尿的作用。有研究表明，绿豆还具有抗肿瘤作用[4]。目前，绿豆在我国和其他亚洲国家常用来制作粥和豆芽，在食品工业中，绿豆被用来生产淀粉和粉丝[5-6]。但是绿豆淀粉加工副产物却很少被高值化利用，绿豆淀粉副产物中含有约20%的蛋白质，且必需氨基酸比例较为全面[7]。近年来，研究发现食源性蛋白水解物具有多种生物活性功能，可提高机体的免疫调节能力[8-10]、抗氧化能力[11]、降血压能力[12]等。调节机体免疫力是预防感染、癌症等多种疾病的重要措施之一，有研究表明，乳蛋白水解物、酪蛋白水解物等动物源蛋白肽具有调节机体免疫力的作用[13-14]，近年来的研究还发现，大豆、玉米等植物源蛋白肽也可改善机体的免疫调节能力[15-17]。黑龙江八一农垦大学食品学院粮食、油脂及植物蛋白工程课题组前期从细胞水平探讨了绿豆肽的免疫调节作用，但绿豆肽在机体中对免疫低下的小鼠是否具有调节免疫功能的作用及其机制还不甚清楚。
本研究以绿豆淀粉加工副产物为原料，采用生物酶法制备绿豆蛋白水解物（MBPH），分析绿豆蛋白水解物对环磷酰胺免疫低下小鼠的免疫器官、脾脏病理学状态、乳酸脱氢酶和酸性磷酸酶活性、细胞因子等指标的影响，以阐明绿豆蛋白水解物对免疫低下小鼠机体的保护作用。
1.1 试验材料
绿豆蛋白（蛋白含量80.02%），购于山东招远温记食品有限公司；
Alcalase 2.4 L，丹麦诺维信公司；
环磷酰胺（cyclophosphamide，CY），购于山西保通药业有限公司；
盐酸左旋咪唑（Levamisole hydrochloride,LH），山东仁和堂制药有限公司；
白介素-10（Interleukin-10，IL-10）、白介素-6（IL-6）、TNF-α、干扰素γ（Interferon gamma，IFN-γ）、IgM（Immunoglobulin M）、IgG（Immunoglobulin G）、乳酸脱氢酶（LDH）商品试剂盒、酸性磷酸酶（ACP）试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。
1.2 实验动物
雄性BALB/c小鼠，体质量（22±2）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。将所有小鼠置于实验饲养室条件（（24±1）℃，50%～60%湿度，正常昼夜循环），自由饮水。
1.3 试验仪器
细胞培养箱，上海玺恒实业有限公司；
紫外分光光度计，美国Thermo公司；
超净工作台，郑州宏朗仪器设备有限公司；
超速冷冻离心机，湖南湘仪有限公司；
电子显微镜，深圳市博视达光学仪器有限公司；
高效液相色谱分析仪，美国Agilent公司；
超声波破碎仪，美国Sonics & Materials Inc.公司。
1.4 试验方法
1.4.1 MBPH的制备及分子量分布参照刁静静等[18]的方法制备绿豆蛋白水解物，绿豆蛋白（10%，W/W）经碱性蛋白酶水解3 h，酶底物比为2∶100。碱性蛋白酶的水解条件为：pH值9.0，50℃。
MBPH分子量分布采用刁静静等[18]的研究方法。采用高效液相色谱仪进行MBPH分子量分布分析。色谱分析条件为：色谱柱TSKgel 2000SWXL（300.0 mm×7.8 mm），流动相为乙腈/水/三氟乙酸（45∶55∶0.1，V/V），洗脱流速0.5 mL/min，柱温恒定为30℃。以细胞色素（MW12 500 u）、抑肽酶（MW6 500 u）、杆菌肽（MW1 450 u）、乙氨酰氨-乙氨酰氨-精氨酸（MW451 u）和乙氨酰氨-乙氨酰氨-乙氨酸（MW189 u）为标准品作相对分子质量的校正曲线，得到保留时间、峰面积、高度和含量，利用回归方程计算MBPH的相对分子质量分布。
1.4.2 动物分组及样本的采集72只小鼠适应性喂养7 d，随机分成6组，分别为正常组（空白对照组，NC）、免疫抑制组（模型组，MC）、绿豆蛋白（mung bean protein，MBP）处理组（对照组）、100 mg/kg MBPH处理组、300 mg/kg MBPH处理组、500 mg/kg MBPH处理组。实验小鼠12只/笼，饲养于SPF级动物房，12 h/12 h昼夜循环光照，保持饲养环境卫生。分组后，每2 d测量1次小鼠体质量，记录各组小鼠体质量变化情况。前3 d，除正常组外，其余各组每隔1 d注射40 mg/kg体质量的CY，正常组注射等剂量的生理盐水。在4～21 d，正常组和模型组口服给予40 mg/kg体质量的蒸馏水，其余4组分别口服给予300 mg/kg MBP和100、300、500 mg/kg MBPH。末次处理24 h后，称质量，颈椎脱臼处死小鼠。
1.4.3 MBPH对小鼠免疫器官的影响参照WANG等[19]的研究方法，颈椎脱臼处死小鼠，取脾脏、胸腺等免疫器官，称其湿质量，并按照公式（1）计算脾脏指数和胸腺指数。
1.4.4 脾脏组织苏木精-伊红（H&E）染色取10%甲醛溶液固定后的小鼠脾脏组织块（约0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm），经脱水、石蜡包埋后，用冷冻切片机将脾脏组织切成5 μm厚的块，然后进行H&E染色，在光学显微镜下进行病理形态学观察。
1.4.5 MBPH对小鼠血液指标的影响小鼠在末次处理24 h后，以乙二胺四乙酸钠为抗凝剂，于处死当日经眼眶采血50 μL。采用全自动血细胞分析仪测定红细胞（red blood cell，RBC）、白细胞（white blood cell，WBC）和血小板（patelet，PLT）等指标。
1.4.6 MBPH对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率的影响采用LI等[20]的研究方法进行测定。末次给药处理后，向各处理组小鼠腹腔注射1 mL 20%鸡红细胞，并轻揉腹部。用2 mL预冷PBS冲洗腹腔，得到小鼠腹腔巨噬细胞。然后将1 mL富含腹膜细胞的灌洗液涂于载玻片上，37℃孵育30 min。随后用PBS洗涤载玻片，采用丙酮和甲醇溶液（1∶1，V/V）固定，4% Giemsa染色10 min。计算100个巨噬细胞消耗的鸡红细胞数，按下式计算吞噬率。
1.4.7 MBPH对小鼠脾淋巴细胞增殖率的影响脾淋巴细胞增殖试验参照WANG等[19]的方法。无菌环境下取出小鼠脾脏，置于冷磷酸盐缓冲液中，剪碎后过0.074 mm医用纱布，收集得到脾细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，取细胞沉淀，加4 mL红细胞裂解液吹打均匀，室温静置5 min后，1 000 r/min离心5 min，取沉淀采用4 mL PBS洗涤3遍，重悬于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养2 h，去除贴壁细胞，悬浮的细胞为脾淋巴细胞，然后按5.0×106个/孔接种于6孔板进行培养。将处于对数生长期的脾细胞按照1.0×104个/孔密度接种于96孔板，按照试验分组进行培养12 h后，采用WST-1法检测细胞增殖，将各组细胞加入20 μL WST-1溶液，置于细胞培养箱内继续孵育2 h后，将96孔板置于摇床上摇动1 min，以充分混匀待检测体系，在波长450 nm处测定吸光值，计算脾淋巴细胞增殖率。
1.4.8 MBPH对 脾 脏LDH和ACPase活 性 的 影响按照1.4.7处理方法无菌取出小鼠脾脏，用聚四氟乙烯玻璃匀浆器匀浆，制成脾脏匀浆液，然后离心10 min，收集上清液，分别采用ELISA试剂盒测定脾脏组织匀浆中的ACPase和LDH含量。
1.4.9 MBPH对小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10、IFN-γ和免疫球蛋白的影响血清TNF-α、IL-6、IL-10、IFN-γ和IgM、IgG采用 酶联免 疫吸附 试验试剂盒进行测定。各处理组小鼠经眼眶采血，3 000 r/min离心10 min，4℃吸取上层血清，使用酶标仪在490 nm处测定吸光度。
1.5 统计分析
采用Statistix 8（分析软件，St Paul，MN）进行数据统计分析，平均数之间显著性差异（P＜0.05）通过Turkey HSD进行多重比较分析。并采用SigmaPlot 13.0作图。
2.1 MBPH分子量分布
根据分子量标准品的保留时间和分子量绘制的标准曲线（图1）得出，＜3 000 u的MBPH约占96.64%。分子量＞3 000 u肽段约占3.36%。LI等[20]研究发现，低分子量的肽段具有较高的细胞增殖能力；
REN等[21]研究表明，低分子量的水解物对小鼠具有较好的免疫调节作用。前期研究结果发现，小分子MBPH在体外可显著提高细胞的免疫活性。因此，MBPH在体内的免疫调节作用将采用＜3 000 u肽段进行研究。
图1 MBPH分子量分布Fig.1 Molecular weight distribution of MBPH
2.2 MBPH对免疫抑制小鼠体质量及免疫器官的影响
MBPH对免疫能力抑制小鼠体质量的影响如图2所示。
图2 MBPH对免疫能力抑制小鼠体质量的影响Fig.2 Effect of MBPH on body weight in immunosuppressive mice
由图2可知，各处理组小鼠的初体质量差异不显著，终体质量、体质量增长率变化差异显著，模型组体质量增长率显著低于其他处理组（P＜0.05）。与模型组相比，MBPH低、中、高剂量组的小鼠体质量增长率有不同幅度增长，且均高于模型组（P＜0.05）。YU等[22]研究发现，在动物模型试验中，采用CY具有一定的免疫抑制作用，会引起机体体质量、免疫器官指数等指标的下降。MBPH低剂量组与MBP处理组差异不显著，本研究结果表明，MBPH可改善免疫抑制小鼠的体质量。
胸腺和脾脏是免疫系统的重要组成部分，免疫器官指标可在一定程度上反映机体的免疫调节水平。从图3可以看出，与对照组相比，模型组的免疫器官指数显著降低（P＜0.05）。不同质量分数MBPH处理组的胸腺和脾脏指数较模型组均发生了显著改善（P＜0.05）。MBP处理组与MBPH高剂量组相比，差异显著（P＜0.05）。目前已有研究证实，油茶籽粕蛋白、麦麸蛋白、大豆蛋白等食源性蛋白质来源的蛋白肽具有促进免疫器官发育的作用。而且WANG等[19]研究发现，牡蛎蛋白水解物能呈剂量性提高脾脏和胸腺指数，这与本研究结果一致。以上研究结果表明MBPH可通过修复CY诱导的免疫器官损伤来改善免疫功能。
图3 MBPH对免疫功能抑制小鼠免疫器官指数的影响Fig.3 Effects of MBPH on organ coefficients andmorphologies in immunosuppressive mice
2.3 MBPH对免疫抑制小鼠脾脏组织结构变化的影响
BPH对CY诱导免疫抑制小鼠脾脏组织病理学影响如图4所示。
图4 MBPH对CY诱导免疫抑制小鼠脾脏组织病理学影响Fig.4 Histopathological effects of MBPH on spleen in immunosuppressive mice
由图4可知，正常组小鼠脾脏红、白髓边缘界限清楚，脾索网络结构良好；
模型组小鼠脾脏红髓与白髓边界模糊。这与SALVA等[23]研究一致，环磷酰胺会引起脾脏病理性变化。MBPH处理组小鼠脾脏对CY诱导小鼠的脾脏病理状态有了较好的改善，随着剂量的增加，小鼠脾脏红髓和白髓之间的边缘逐渐清晰，中、高剂量组脾脏与NC组差异不显著。这与YAO等[24]和SAINT-SAUVEUR等[25]研究结果一致，免疫活性肽可提高免疫系统器官指数，修复脾脏的病理组织结构。
2.4 MBPH对免疫抑制小鼠血液指标的影响
表1是MBPH对CY诱导免疫抑制小鼠血液指标的影响。血液中包含大量的免疫细胞，是免疫应答发生的重要场所之一。血液中的免疫细胞和免疫活性物质共同构成机体的血液免疫屏障，在机体防御外界病原体入侵和发挥免疫防御方面发挥着重要的作用。由表1可知，模型组小鼠血液中RBCs、WBCs、PLTs均显著下降（P＜0.05）。RBCs和WBCs均被证实与机体的免疫功能相关，RBC数目下降会影响免疫器官的功能，WBC是观察、诊断免疫低下疾病和急性感染性疾病的重要指标。PLT具有介导炎症反应、激活机体免疫系统、促进伤口愈合的作用，因此，模型组的结果表明CY可引起机体血液屏障的损害，降低机体免疫防御能力；
MBPH处理组可显著提升血液指标中RBCs、WBCs、PLTs和Hb水平（P＜0.05），且RBCs和Hb水平和正常组无显著性差异（P＞0.05）。以上结果表明，MBPH对CY诱导免疫抑制小鼠的免疫功能具有显著改善作用。
表1 MBPH对免疫能力抑制小鼠血液指标的影响Tab.1 Effect of MBPH on blood indexes in immunosuppressive mice
2.5 MBPH对免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率的影响
MBPH对免疫能力抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响如图5所示。
图5 MBPH对免疫能力抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率的影响Fig.5 Effect of MBPH on macrophage phagocytosis in immunosuppressive mice
巨噬细胞是一种来源于单核细胞的吞噬细胞，它既参与非特异性免疫，又参与特异性免疫。外源刺激可激活巨噬细胞，从而引起宿主的免疫反应。与NC组比较，CY诱导组腹腔巨噬细胞吞噬率受到显著抑制；
MBPH组则显著提高了CY诱导小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率（P＜0.05），尤其是高剂量MBPH组的吞噬率与NC组差异不显著（P＞0.05）。这与YU等[22]研究结果一致，低分子量蛋白水解物可通过增加小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬率来提高巨噬细胞的功能，其具有免疫增强性。
2.6 MBPH对免疫低下小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力的影响
MBPH对免疫能力抑制小鼠脾脏淋巴细胞增殖率的影响如图6所示。
图6 MBPH对免疫能力抑制小鼠脾脏淋巴细胞增殖率的影响Fig.6 Effect of MBPH on the proliferation of splenic lymphocytes in immunosuppressive mice
脾脏淋巴细胞增殖是评价免疫增强的重要指标。由图6可知，与NC组相比，CY诱导组的脾脏淋巴细胞增殖显著减少（P＜0.05），MBPH组的细胞增殖率则呈剂量性增加，高剂量组的细胞增殖率与NC组差异不显著（P＞0.05）。SHIMIZU等[26]研究结果表明，低分子量的小肽具有促进脾细胞增殖的作用。本研究结果表明，MBPH可能是通过增强脾脏淋巴细胞增殖，恢复细胞免疫功能，从而缓解CY诱导的小鼠免疫器官损伤，最终恢复细胞免疫功能。
2.7 MBPH对脾脏匀浆中ACPase和LDH活性的影响
ACPase活性反映巨噬细胞的活化程度。MBPH对脾脏ACPase活性的影响如图7所示，模型组脾脏ACPase水平明显低于正常组小鼠（P＜0.05）。MBPH处理组小鼠脾脏ACPase水平呈剂量依赖性升高（P＜0.05）。ACPase活性与机体的自然免疫能力密切相关，说明MBPH能增强机体对外源性病原体的吞噬和细胞内降解能力。模型组小鼠脾脏LDH活性明显低于正常对照组小鼠（P＜0.05）。本研究发现，CY能够促进巨噬细胞凋亡，降低巨噬细胞活力，抑制巨噬细胞的防御功能，导致免疫活性物质LDH和ACPase降低。MBPH处理可显著升高脾脏LDH水平。MBPH-H组与正常组LDH水平无显著性差异（P＞0.05），该结果与MA等[27]研究结论 一 致。CHALAMAIAH等[28]研 究也发现，免疫活性肽可提高机体的LDH和ACPase水平。基于以上结果，MBPH可增强免疫抑制小鼠的免疫活性。
图7 MBPH对免疫抑制小鼠脾脏ACPase和LDH活性的影响Fig.7 Effect of MBPH on the ACPase and LDH activities of the spleens in immunosuppressive mice
2.8 MBPH对免疫抑制小鼠细胞因子的影响
MBPH对免疫能力抑制小鼠血清细胞因子的影响如图8所示。
图8 MBPH对免疫能力抑制小鼠血清细胞因子的影响Fig.8 Effect of MBPH on serum cytokines in immunosuppressive mice
从图8可以看出，模型组的IL-10、IL-6、TNFα和IFN-γ等细胞因子水平均显著低于正常组和其他处理组（P＜0.05），表明CY可显著抑制机体的免疫应答反应。MBPH-M、MBPH-H组可显著提高小鼠血清中TNF-α水平（P＜0.05），且与正常组差异不显著（P＞0.05）。TNF-α可调控机体的多个系统，尤其在免疫和炎症反应及机体生长代谢方面有着不可或缺的功能，本研究结果表明，MBPH可显著改善CY诱导免疫低下小鼠的免疫和炎症反应。IL-10和IL-6具有刺激T、B淋巴细胞增殖、分化、成熟的生物学效应，还具有促进造血肝细胞和巨噬细胞等增殖和活性增强等作用。从图8可以看出，与正常组相比，模型组的IL-10和IL-6水平显著下降（P＜0.05），MBPH-M、MBPH-H组可显著提升IL-10和IL-6水平（P＜0.05）。IFN-γ是特异性免疫的调节剂，能诱导Th0型细胞分化成Th1型细胞，并且能激活巨噬细胞、细胞毒性T细胞和清除胞内病原体。与正常组相比，模型组的IFN-γ水平显著下降（P＜0.05），这表明CY可以显著抑制机体IFN-γ的分泌和表达；
与模型组相比较，MBPH-M、MBPH-H组可显著提高免疫低下小鼠的IFN-γ水平（P＜0.05），且和正常组无显著性差异（P＞0.05）。以上结果表明，MBPH中高剂量组可显著改善CY诱导免疫抑制小鼠机体的细胞因子水平，提高机体的免疫活性。
2.9 MBPH对免疫能力抑制小鼠IgM和IgG的影响
图9反映的是MBPH对免疫抑制小鼠抗体水平的影响。IgM是机体初次免疫应答中分泌最早的抗体，在抵御原发性感染的过程中发挥着重要作用。IgG是体液免疫应答所产生的主要抗体，约占血清中抗体总量的80%，具有抗菌、中和病毒及免疫调节等生物活性。当机体抗原部位处有足够多的IgG分子，就能以适当构型聚集在抗原表面进行激活补体级联反应，进一步增强IgG的免疫效能。由图9可知，与正常组相比，模型组的IgM、IgG水平显著下降（P＜0.05），这表明CY能显著抑制机体IgM和IgG抗体的分泌和表达；
与模型组相比，MBPH组可呈剂量依赖性改善免疫抑制小鼠的抗体水平，且差异显著，其中MBPH-M、MBPH-H组显著提高机体血清的IgM和IgG水平（P＜0.05），且IgG水平与对照组差异不显著（P＞0.05）。这表明MBPH可显著改善CY诱导免疫抑制小鼠机体的炎症反应，提高机体的免疫应答能力。
图9 MBPH对免疫能力抑制小鼠抗体水平的影响Fig.9 Effect of MBPH on antibody levels in immunosuppressive mice
本研究表明，低分子量MBPH可改善免疫抑制小鼠的体质量，促进免疫器官指数和脾脏状态的恢复；
MBPH还可通过改善免疫抑制小鼠的脾脏淋巴细胞增殖、腹腔巨噬细胞吞噬能力，增强机体的免疫活性；
通过血液细胞分析得出，MBPH能显著改善免疫抑制小鼠的白细胞水平；
MBPH还可提高血清中TNF-α、IFN-γ、IgM、IgG等水平，提高体液免疫活性。低分子量MBPH可作为功能性营养成分应用于食品领域。本文仅研究了绿豆蛋白水解物对机体免疫活性的影响，但MBPH是通过何种途径提高机体免疫活性的作用机制还不清楚，今后需要开展这方面的研究。