孙东映，韦锦斌
（1.广西医科大学第三附属医院，南宁 530031；
2.广西医科大学，南宁 530021）
酗酒已成为当今世界备受关注的健康问题，造成了重大的社会和经济负担。近年来，我国酗酒人数逐年上升并且逐渐年轻化，导致酒精性肝损伤的发病率不断升高[1]。酒精性肝损伤的形成是一个较为复杂的过程，初期症状以酒精性脂肪肝为主，逐渐进展为酒精性肝炎和酒精性肝硬化，直至肝功能衰竭[2-3]。目前，酒精性肝损伤的发病机制尚未完全阐明。戒酒、药物治疗以及外科肝移植依旧是酒精性肝损伤的主要干预措施[4]。海参是广泛分布于全世界各大洋中的一类无脊椎海洋生物，同时也是调节海洋生态系统的最重要的物种之一[5]。海参除了含有丰富的蛋白质、矿物质和维生素等营养成分外，还富含多种生物活性物质，如海参多糖、三萜皂苷、海参肽、胶原蛋白、脂类物质等[6-8]。研究表明，海参具有抗氧化、抗炎、提高免疫、抗肿瘤、降脂、抗血栓、保肝、延缓衰老等药理作用[9]。本研究通过酒精灌胃法建立急性酒精性肝损伤小鼠模型，以保肝药物水飞蓟宾为阳性药物作为对比，研究海参酶酵液（HSMJY）对急性酒精性肝损伤的作用，为HSMJY 应用于急性酒精性肝损伤的防治提供实验依据。
1.1 实验动物 60 只SPF 级昆明小鼠，雄性，体重（20±2）g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（桂）2020-0003，动物使用许可证号：SYXK（桂）2020-0004。本研究所涉及的动物实验操作均严格遵守广西医科大学实验动物中心动物伦理委员会的指导原则。
1.2 药物 HSMJY由广西医科大学基础医学院微生物教研室提供，批号：20220104。250 g生海参（大连产刺参，去除内脏），先用蛋白酶酶解，后用益生菌发酵，得到960 mL 的HSMJY，海参含量为26%。水飞蓟宾胶囊购自天津天士力圣特制药有限公司，批号：150711078。
1.3 主要试剂和仪器 丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、蛋白定量（TP）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；
白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒均购自上海泛柯实业有限公司；
无水乙醇（AR）购自广东光华科技股份有限公司。
高速冷冻离心机（德国Hettich UNIVERSAL，型号320R台式）；
电热恒温干燥箱（上海跃进医疗器械厂，型号GZX-DH 400-S-II）；
-80 ℃超低温冰箱（青岛海尔特种电器有限公司，型号DW-86L628）；
全波长全自动多功能酶标仪（美国Thermo Fisher，型号Multiskan Go）。
1.4 动物分组、给药及造模 所有小鼠适应性喂养1 周后，随机分为正常组、模型组、水飞蓟宾组（50 mg/kg）、HSMJY 高剂量（HSMJY-H）组（7.8 g/kg）、HSMJY 中剂量（HSMJY-M）组（5.2 g/kg）、HSMJY低剂量（HSMJY-L）组（2.6 g/kg），每组10 只。实验第1～9 天：各给药组小鼠灌胃给予相应剂量药物，正常组与模型组灌胃给予等体积的蒸馏水，1 次/d，连续9 d。第9～12天：即实验第9天起，每天上午正常给予相应剂量药物，1 h 后除正常组外，其余组小鼠灌胃40%乙醇溶液（10 mL/kg），连续4 d。造模参考Song 等[10-11]方法改良，建立小鼠急性酒精性肝损伤模型，同时正常组小鼠灌胃等体积蒸馏水。
1.5 标本制备 末次给予乙醇溶液后，禁食不禁水4 h。摘眼球取血，室温静置2 h，3500 r/min 离心10 min，取上层血清分装于不同EP 管内，保存于-80 ℃冰箱中备用。取血后颈椎脱臼法处死小鼠，解剖取肝脏组织，称重。用4%多聚甲醛固定部分肝脏组织，留待病理检测；
其余肝组织加入9倍量生理盐水制备10%肝匀浆液，3 500 r/min离心10 min，取上清液分装，保存于-80 ℃冰箱中备用。
1.6 肝脏指数检测 迅速解剖后取出肝脏，用0.9%生理盐水洗去血液，滤纸吸净后称定肝脏重量，计算小鼠肝脏指数，肝脏指数＝肝脏重量（g）/体重（g）×100%。
1.7 生化指标测定 检测各组小鼠血清AST、ALT含量，测定肝脏组织SOD 活性及MDA、IL-1β、IL-6和TNF-α含量，具体实验方法参照试剂盒说明书进行操作。
1.8 肝脏组织病理学观察 4%多聚甲醛固定24 h后，常规透明、脱水、石蜡包埋，连续切片，行苏木精—伊红（HE）染色，于光学显微镜下观察肝组织病理改变。
1.9 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2.1 HSMJY对小鼠肝脏指数及血清肝功能酶学指标的影响 与正常组比较，模型组小鼠肝脏指数和血清AST、ALT活性升高（P＜0.01）；
与模型组比较，HSMJY-H 组、HSMJY-M 组及水飞蓟宾组小鼠肝脏指数和AST、ALT活性降低（P＜0.05），见表1。
表1 HSMJY对小鼠肝脏指数及血清AST、ALT水平的影响n=10，
与正常组比较，*P＜0.01；
与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
2.2 HSMJY对小鼠肝组织病理学变化的影响 正常组小鼠肝组织细胞结构完整且肝细胞索排列整齐，细胞核清晰可见，位于细胞中央，肝小叶结构清晰，肝细胞无明显的脂肪泡、或变性坏死，无炎症细胞浸润；
模型组小鼠肝细胞形态不规则，肝细胞索排列紊乱，肝细胞内出现大小不等、数量较多的圆形脂肪空泡（脂滴），出现炎症细胞浸润现象，肝小叶结构模糊，少部分肝细胞核固缩，表明急性酒精性肝损伤模型复制成功；
与模型组比较，水飞蓟宾组及HSMJY各剂量组的小鼠肝脏组织的病理损伤均有改善，并且以高剂量的作用效果较好，见图1。
2.3 HSMJY对小鼠肝脏氧化应激指标的影响 与正常组比较，模型组小鼠肝脏抗氧化酶SOD活性降低，MDA 含量显著升高（均P＜0.01）；
与模型组比较，HSMJY 及水飞蓟宾可显著提高SOD 活力，降低MDA含量（P＜0.01），见表2。
表2 HSMJY对小鼠SOD活性和MDA含量的影响n=10，
表2 HSMJY对小鼠SOD活性和MDA含量的影响n=10，
与正常组比较，*P＜0.01；
与模型组比较，#P＜0.01。
2.4 HSMJY对小鼠肝脏炎症指标的影响 与正常组比较，模型组小鼠肝脏炎症因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量显著升高（P＜0.01）；
与模型组比较，HSMJY 中、高剂量及水飞蓟宾均可降低炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量（P＜0.05），见表3。
表3 HSMJY对小鼠IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影响n=10，
表3 HSMJY对小鼠IL-1β、IL-6和TNF-α含量的影响n=10，
与正常组比较，*P＜0.01；
与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
本研究通过直接酒精灌胃方法构建小鼠急性酒精性肝损伤模型，该方法具有周期短、容易复制、稳定性好、死亡率低等优点，与人类在短时间内大量饮酒所致的肝脏损伤特点相似；
并且以肝脏及血液中一些化学指标的变化为主要特征，为进一步研究急性酒精性肝损伤的发病机制以及后续保肝药物研究与开发提供了一种可行方法。
肝脏指数可反映肝脏肿大的程度，而肝脏肿大则被认为是酒精性肝损伤的一种常见临床表现[12]。AST、ALT是肝功能评估中敏感的生化指标[13]，主要分布于肝细胞质中，临床上利用这两个指标水平来代表肝损伤的严重程度，一般情况下，当肝脏受到某些有害因素的影响，肝细胞被破坏，肝脏受损，导致大量AST和ALT被释放入血，促使血液中AST和ALT 水平显著提高[14]。本研究结果显示，模型组小鼠较正常组肝脏指数及血清AST、ALT 水平显著升高，表明肝细胞受到损伤，急性酒精性肝损伤模型成功建立。HSMJY 各剂量组对急性酒精性肝损伤小鼠的肝脏肿胀有一定抑制作用，能改善肝脏病变，使血清AST、ALT活性恢复正常，进而达到保护肝脏的作用。同时，本研究发现模型组中小鼠肝脏发生损伤，其肝脏组织病理学变化主要表现为肝细胞形态不规则，肝细胞索排列紊乱，出现较多的脂滴（脂肪堆积的明显特征），出现了炎症细胞浸润现象，肝小叶结构模糊，少部分肝细胞核固缩。不同剂量HSMJY 干预可以改善这些异常改变，减少肝脏损伤。
氧化应激在急性酒精性肝损伤病程的发展过程中发挥重要作用。酒精在代谢过程中会产生大量的活性氧（ROS），造成机体的氧化及抗氧化防御功能失衡，进而引起氧化应激，是急性酒精性肝损伤产生和发展的一个重要机制[15]。SOD和MDA均会受到氧化应激条件的影响。SOD 活性的降低将引起氧自由基的累积，进而诱发细胞损伤，间接对机体清除氧自由基的能力产生影响。MDA 作为脂质过氧化的最终产物，不仅可以反映人体内的脂质过氧化水平，还能间接地反映人体肝细胞的损伤程度[16]。本研究结果显示，模型组小鼠肝脏中SOD活性显著降低，同时MDA的含量明显升高，表明在模型组小鼠体内发生了较为严重的氧化应激反应。然而，HSMJY 干预处理可显著提高小鼠肝脏中SOD 活性，减少肝脏中MDA 的含量。这一结果表明，HSMJY 可增强肝细胞的抗氧化能力，具有良好的抗氧化应激能力，进而减少酒精所诱导的急性肝脏损伤，这可能与其所含的抗氧化成分有关。
在酒精性肝损伤情况下，不仅氧化应激系统发生异常，还常常伴有炎症反应的发生。炎症反应对肝脏造成损伤，炎症细胞激活后分泌的大量炎症因子对酒精所诱导的急性肝损伤进程起到十分重要的作用。炎症反应会导致肝脏实质性损伤，进而发展为肝纤维化甚至肝功能衰竭[17]。在机体受到酒精的刺激后，会诱发促炎细胞因子的释放，包括TNFα、IL-1β和IL-6等[18]，而这些促炎细胞因子可引发脂肪变性，造成肝细胞炎性损伤及凋亡，加速急性酒精性肝损伤的发展。本研究结果显示，正常组小鼠肝组织中IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量较低，急性酒精性肝损伤可显著增加这些炎症因子，提示IL-1β、IL-6和TNF-α可能参与了急性酒精性肝损伤的发生和发展。而HSMJY 能显著降低IL-1β、IL-6 和TNF-α的水平，表明HSMJY 还可能通过抗炎作用从而发挥抗急性酒精性肝损伤作用。
海洋生物因独特而丰富的生理和药理活性而受到关注，用于开发新型食品及药物具有巨大潜力。本研究所采用的HSMJY 与传统海参食品比较，酶解发酵可将海参大分子蛋白分解为易吸收的小分组蛋白质、寡肽、小肽和游离氨基酸等，所得产物具有活性成分丰富，营养价值高，稳定性和溶解性良好，易于消化和吸收，食用安全等特点。HSMJY中不仅含有海参多肽，而且还含有其他一些活性强的化合物，如多糖、皂苷及脑苷脂等。近年来，关于海参提取物各种生物活性已在多种干预处理模型中均有过报道。本研究主要评价了HSMJY在小鼠体内抗急性酒精性肝损伤活性，并未明确分析其具体起作用的活性组分，因此后续将做进一步研究。
综上所述，HSMJY对小鼠急性酒精性肝损伤具有一定的保护作用，其机制可能与抑制氧化应激和炎症反应有关。
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