林 锟，吴逸希，曾 琼
（1．汕头大学医学院第一附属医院内分泌代谢科，广东 汕头 515041；
2．汕头大学医学院第一附属医院神经内科，广东 汕头 515041）
1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是对儿童青少年危害重大的自身免疫性疾病，其发病机制尚未十分清楚，亦缺乏早期血清学标志物[1]。环状RNA（circular RNA，circRNA）是一类特殊非编码RNA分子，其分子属封闭环状结构，表达稳定，不易降解[2]。这使得circRNA在作为新型临床诊断标记物的开发上具有明显优势。这是一种新的、高度敏感的生物标记物，具有很高的价值。研究发现circRNA参与了疾病的发生发展，包括自身免疫性疾病[3]。目前关于T1DM与circRNA的相关性研究较少。本研究假设circRNA通过多种基因表达调控机制影响T1DM的发生发展，在胰岛细胞损伤早期circRNA即出现差异表达，由于circRNA的高度稳定性，异常表达的circRNA可在血液中被检测出并作为未来T1DM一种新的、高度敏感的生物标记物。本研究通过采用circRNA芯片检测T1DM患者和正常人群外周血circRNA表达谱，采用生物信息学方法预测靶微RNA（micro RNA，miRNA），探讨circRNA可能参与的T1DM分子机制。
1.1 研究对象
选取2021年7—12月于汕头大学医学院第一附属医院内分泌科住院治疗的T1DM患者3例，均符合T1DM诊断标准。排除标准包括其他类型糖尿病、肝肾功能障碍、急性应激状态、恶性肿瘤、心脑血管疾患和妊娠患者。同时纳入性别、年龄与T1DM患者匹配的健康对照者3名。本研究经汕头大学医学院第一附属医院伦理委员会审核批准，所有研究对象均签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 临床资料收集 收集临床资料、体格检查并常规进行血脂、空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血红蛋白、血脂和肝肾功能检测。
1.2.2 基因芯片检测 空腹抽取静脉血5 mL，放入乙二胺四乙酸，抗凝管颠倒混匀后，放于-80℃冰箱储存备用；
采用Trizol（美国Invitrogen公司）提取总RNA，其浓度、纯度采用分光光度计测定，样品合格后采用3′→5′核糖核酸外切酶消化线性RNA分子，互补DNA进行扩增、标记（荧光），Agilent TapeStation系统进行杂交、清洗，成像通过Axon基因芯片扫描仪呈现，circRNA差异表达谱采用GenePixPro 6.0软件分析。
1.2.3 实时荧光定量PCR检测 选择差异倍数较大的circRNA进行实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）检验。总RNA反转录获得cDNA模板后使用qPCR仪（Applied Biosystems 7900）进行扩增，以U6作为内参，circRNA的相对表达水平以计算。引物见表1。
表1 qPCR引物
1.3 统计学处理
使用SPSS 18.0统计学软件分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；
非正态分布计量资料以M（Q1，Q3）表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。
2.1 临床资料
T1DM组患者年龄和性别分别为男14岁，男21岁，女18岁，平均糖化血红蛋白为12.82%。对照组为性别、年龄1∶1匹配入组，糖化血红蛋白均小于6%。
2.2 芯片检测结果
两组患者外周血样本circRNA芯片的筛选，上调共5 134个，下调共5 426个；
69个circRNA差异有统计学意义（P＜0.05，|logFC|＞1.5），其中64个上调，5个下调，见图1。
图1 1型糖尿病患者外周血环状RNA差异表达
2.3qPCR验证
选取|log FC|改变更为明显的5个circRNA通过qPCR验证发现，TIDM组与对照组相比hsa_circ_101079、 hsa_circ_100332、 hsa_circ_085129 及hsa_circ_103845表达差异均有统计学意义（P值均＜0.05），hsa_circ_006157在两组间表达差异无统计学意义（P=0.48）。见图2。
图2 qPCR验证差异表达环形RNA
近年来，非编码RNA在表观遗传学的作用越来越受到重视。在所有非编码RNA中，长链非编码RNA和microRNA等早已被人熟知。而circRNA则是全新领域，与人类疾病的发生、发展有着密切的关联，是一种充满前景的分子标志物和治疗靶点。circRNA在各种疾病发病机制中发挥重要作用，包括癌症、动脉粥样硬化、骨关节炎、肺纤维化、肌强直性营养不良和阿尔茨海默病[3]。在糖尿病领域，虽然circRNA的相关研究较少，但已有让人欣喜的收获。Stoll等[4]发现circRNA是细胞活动的新调控因子，在糖尿病发生时参与了β细胞的功能失调。此外，circRNA cdr1as在胰岛细胞功能和胰岛素分泌中起着重要作用[5]。临床研究方面，有研究通过微阵列分析比较了2型糖尿病患者和对照组受试者外周血中circRNA的表达情况，并在较大的独立队列中进行验证，结果提示hsa-circ-0054633是糖尿病前期和2型糖尿病诊断的生物标志物[6]。
目前涉及T1DM的机制研究较欠缺。本研究通过circRNA芯片检测T1DM患者和正常人群外周血circRNA表达谱，共筛选出4个目的circRNA，分别为hsa_circ_101079、hsa_circ_100332、hsa_circ_085129及hsa_circ_103845。qPCR验证结果表明，这4个circRNA可能成为T1DM和健康个体的新生物标志物。本研究入组病例数虽较少，但诊断准确度较高。我们的研究成果与Li等[7]的研究基本一致。和目的circRNA紧密结合的miRNA与正常免疫反应和自身免疫疾病的发病机制有关[8]。例如，hsa_circRNA_100332靶向结合的hsa-miR-892a在从潜伏性结核向活动性结核的炎症转变期间在CD4+T细胞中下调[9]。hsa_circRNA_085129靶向的hsa-miR-145-5p通过抑制炎症因子的分泌改善巨噬细胞的炎症状态[10]，被认为是多发性硬化症的生物标志物[11]。hsa_circRNA_103845靶向的hsa-miR-127-3p属胰岛特异性miRNA，与胰岛素生物合成和分泌密切相关，其能被脂多糖下调，可能参与脂多糖触发的T1DM发展[12]。因此，我们观察到的所有上游circRNA的上调预示着一种促炎症状态，这可能是T1DM病因的基础。本研究预测胰岛特异性miRNA如hsa-miR-493-5p和hsa-miR-127-3p会被抑制，这可能反映了T1DM中胰岛β细胞的破坏状态。
综上所述，T1DM患者外周血hsa_circ_101079、hsa_circ_100332、hsa_circ_085129及hsa_circ_103845表达显著上调，可能通过靶miRNAs调控相关信号通路参与T1DM的发生发展。
猜你喜欢 汕头大学胰岛外周血 临床胰岛制备研究进展医学信息(2022年9期)2022-11-27外周血B细胞耗竭治疗在狼疮性肾炎中的应用进展现代临床医学(2022年2期)2022-04-19外周血G6PD活性检测对于感染高危型人乳头瘤病毒宫颈癌患者的诊断预后价值昆明医科大学学报(2022年2期)2022-03-29ACS患者血清FSTL-1、外周血淋巴细胞中PPAR-γ、 MMP-9与冠状动脉狭窄程度的关系天津医科大学学报(2021年4期)2021-08-21乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞与临床特征的关系感染、炎症、修复(2021年1期)2021-07-28解析李嘉诚经营管理成功之道商情(2020年44期)2020-12-09人工胰岛成功用于小鼠旗帜文摘(2020年5期)2020-06-09人工胰岛成功用于小鼠科学大观园(2020年7期)2020-04-08陈志胜东坡赤壁诗词(2017年3期)2017-07-05率真鲜活 生动独特世界知识画报·艺术视界(2009年10期)2009-05-29