李东辉，吴红伟，李国峰，杨新荣，司昕蕾，边甜甜，张育贵，李越峰*
1甘肃中医药大学；
2甘肃省中药制药工艺工程研究中心，兰州 730000
大黄为蓼科植物掌叶大黄RheumpalmatumL.、唐古特大黄RheumtanguticumMaxim.ex Balf.或药用大黄RheumofficinaleBaill.的干燥根和根茎[1]，主要含有蒽醌类、鞣质类、酚酸类等成分，具有泻下、抗炎、抑菌等药理作用[2]。已有研究表明色度学分析方法和机器视觉技术可客观评价药材颜色[3]。近年来，大黄在化学成分、药理作用及产地加工等方面研究较多，但对大黄颜色研究虽有涉及但并不全面。中药材如同果蔬类，其颜色变化与酶促褐变及非酶促褐变密切相关[4]。酶促褐变是指在多酚氧化酶、过氧化物酶、氧化酶结合底物在有氧条件下反应形成醌，醌类物质进一步聚合生成黑色素[5]。
多酚氧化酶(polyphenol oxidases，PPO)是存在于动物、植物及微生物中的一类含铜离子蛋白酶。多酚氧化酶主要包括酪氨酸酶(tyrosinases)、儿茶酚氧化酶(catechol oxidases)及漆酶(laccases)具有催化酚类物质生成醌，醌类物质与氨基酸、蛋白质发生亲核反应形成褐色聚合物[6]。过氧化氢酶(catalase)是一类金属酶，其又是过氧化物酶体(peroxidases，POD)的标志酶，约占过氧化物酶体酶总量的40%[7]。过氧化物酶是植物在逆境条件下防御系统的关键酶之一，可调控超氧化物歧化酶及过氧化氢酶水平，具有氧化酚类化合物、清除过氧化氢和酚类、胺类毒性的作用，研究也表明多酚类为过氧化物酶及多酚氧化酶的主要底物[8]。高效液相及质谱具有专属、灵敏度和准确性高的特点被广泛用于医药行业[9，10]。分子对接(molecular docking)是指利用计算机技术，依据计算物理化学参数来预测配体(蛋白质、DNA/RNA、小分子)与受体蛋白生物大分子的结合模式及亲合力[11]。本文采用HPLC技术及色差仪技术研究大黄鲜切过程成分变化及切面颜色，采用UPLC-MS/MS技术对大黄化学成分进行定性分析，采用HPLC技术及LC-MS技术对体外模拟反应体系进行检测，采用分子对接技术预测酪氨酸酶与没食子酸、儿茶素、大黄素等的结合能力，这为后续从多酚类物质褐变反应转向蒽醌类物质褐变反应研究提供基础。
1.1 材料
1.1.1 药材
新鲜大黄采自陇南市礼县石桥镇(采购时间：2021.11)，经甘肃中医药大学中药鉴定教研室王明伟副教授鉴定为蓼科植物掌叶大黄RheumpalmatumL.的新鲜根及新鲜根茎。
1.1.2 试剂
甲醇、乙腈、磷酸(色谱级，天津市大茂化学试剂厂)；
无水碳酸钠(分析纯，烟台市双双化工有限公司)；
没食子酸(CAS149-91-7)，由成都普思生物科技有限公司提供，对照品质量分数均大于98%；
多酚氧化酶(CAS#9002-10-2)、过氧化氢酶(CAS#9002-05-2)均由合肥博美生物科技有限责任公司提供。
1.1.3 仪器设备
SHIMADZU Nexera X2超高效液相色谱仪(岛津公司)；
AB4500 Q TRAP质谱(AB SCIEX公司)；
1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；
SC-10色差仪(深圳三恩驰科技有限公司)；
BT125D型十万分之一分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；
1290-6460液相串联三重四极杆质谱仪(美国Agilent公司)。
1.2 方法
1.2.1 大黄样品制备
将大黄药材除去泥土、须根，刮去外皮，按《中国药典》(2020版，一部)规定及本课题组前期研究基础[12]切制成厚度为2.5 mm的饮片，将上述饮片分为2.0 g若干份，晾干，在0、1/6、1/2、1、2、4、8、12、24、36 h时间点(0～36 h内，即晾干过程)依次取上述样品标为1～10号。
1.2.2 基于色差仪的样品颜色测定
测定光源为D65；
色彩空间为CIE，Lab；
侦测器为硅光电二极管；
测量孔径Φ = 4 mm；
定位方式为光照定位和十字架定位；
光源为LED蓝光激发。为减少不同仪器间产生的误差，故选定一张白纸为标准样品，将“1.2.1”项1～10号样进行色度值测量，重复测量3次，取平均值，按公式E*ab=(L*2+a*2+b*2)1/2计算总色差值[13]。
1.2.3 基于HPLC技术的大黄样品测定
1.2.3.1 供试品制备
将“1.2.1”项下1～10号样品依次切碎研细，加25 mL甲醇于锥形瓶中，称定质量，超声40 min，冷却，甲醇补足减失质量，过0.45 μm滤膜，并储存在样品瓶中进行测定分析。
1.2.3.2 色谱条件
色谱柱Eclipse Plus C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流动相乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱：0～15 min，2%→15% A；
15～20 min，15%→20% A；
20～30 min，20%→20% A；
30～60 min，20%→30% A；
60～80 min，30%→55% A；
80～90 min，55%→75% A；
90～95 min，75%→80% A；
95～100 min，80%→100% A；
进样量10 μL；
检测波长为254 nm；
柱温30 ℃；
流速0.8 mL/min。将“1.2.3.1”项1～10号样按“1.2.3.2”条件进样测定。
1.2.4 基于UPLC-MS/MS技术的大黄样品定性分析
1.2.4.1 供试品制备
将“1.2.1”项下10号样品粉碎过50目筛，取1.0 g加25 mL甲醇于锥形瓶中，称定质量，超声40 min，冷却，甲醇补足减失质量，过0.22 μm滤膜，并储存在样品瓶中，由上海拜谱生物科技有限公司进行测定分析。
1.2.4.2 色谱条件
Agilent SB-C18(2.1 mm × 100 mm，1.8 μm)。流动相由溶剂A，含0.1%甲酸的纯水，以及溶剂B，含0.1%甲酸的乙腈组成。在9 min内，对5% A和95% B进行线性梯度分析，并将5% A和95% B保持1 min。随后，在1.1 min内调整为95% A，5.0% B的成分，并保持2.9 min。流速设定为每分钟0.35 mL；
柱温设定为40 ℃；
进样量为4 μL。流出物与ESI-三重四极杆线性离子阱(QTRAP)-MS交替连接。
1.2.4.3 质谱条件
离子源，涡轮喷射；
源温度550 ℃；
离子喷射电压(IS)5 500 V(正离子模式)/-4 500 V(负离子模式)；
离子源气体I(GSI)、气体II(GSII)、帘气(CUR)分别设置为50、60和25.0 psi；
碰撞激活解离(CAD)为高，碰撞气体(氮气)设置为中等，每个离子对是根据优化的去簇电压(DP)和碰撞能(CE)进行扫描。
1.2.4.4 数据处理及分析
利用软件Analyst1.6.3 处理质谱数据。通过筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度，用MuliaQuant软件打开样本下机质谱文件，进行色谱峰的积分和校正工作。检索Massbank(http://www.massbank.jp)数据库及上海拜谱生物科技有限公司自建数据库进行成分结构鉴定。
1.2.5 溶液制备
1.2.5.1 粗酶液制备
将“1.2.1”项下1号样品迅速切碎研细于(已冰浴)研钵中，加入10 mL预冷的pH 7.0磷酸盐缓冲液，在4 ℃，10 000 r/min条件下高速离心15 min，得上清液即为粗酶液[14]。
1.2.5.2 多酚氧化酶液及过氧化氢酶液的制备
称取5.00 mg多酚氧化酶固体及5.00 mg过氧化氢酶固体以蒸馏水分别定容于5 mL容量瓶中即得。
1.2.5.3 反应底物的配制
称取没食子酸25.00 mg，加蒸馏水定容至5 mL，即得对照品溶液。取配置好的对照品溶液1 mL以蒸馏水稀释至2 mL作为没食子酸反应液。
1.2.6 体外模拟褐变反应体系的构建
将试管标记为A0(反应组)、A1(对照组)。A0：0.5 mL没食子酸反应液 + 0.5 mL多酚氧化酶液(或粗酶液)+ 2 mL pH 7.0磷酸缓冲液，A1：0.5 mL没食子酸反应液 + 0.5 mL蒸馏水 + 2 mL pH 7.0磷酸缓冲液，设定反应体系温度为30 ℃，以构建多酚氧化酶与没食子酸的体外反应体系。分别在反应0 h、36 h时取样1 mL，加入等体积的甲醇，终止反应，即为不同反应时间点测定组[15]。
将试管标记B0(反应组)、B1(对照组)。B0：0.5 mL没食子酸反应液 + 0.5 mL过氧化氢酶液(或粗酶液)+ 2 mL pH 8.0磷酸缓冲液，B1：0.5 mL没食子酸反应液 + 0.5 mL蒸馏水 + 2 mL pH 8.0磷酸缓冲液，设定反应体系温度为30 ℃，构建过氧化氢酶与没食子酸的体外反应体系。分别在反应0 h、36 h时取样1 mL，加入等体积的甲醇，终止反应，即为不同反应时间点的测定组[15]。
1.2.7 基于HPLC技术分析酶促褐变反应
Eclipse Plus C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)。流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱：0～5 min，2% →10% A；
5～10 min，10%→15% A；
10～40 min，15%→90% A。进样量10 μL；
检测波长320 nm；
柱温25 ℃；
流速为1 mL/min。采用HPLC法对各反应体系0 h及36 h反应体系液的底物与产物进行测定分析。
1.2.8 基于LC-MS技术分析酶促褐变反应
色谱条件：色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm × 50 mm × 1.8 μm)，柱温35 ℃，流速0.3 mL/min，进样量10 μL，流动相为0.1%的甲酸水(A)-甲醇(B)，以10% A及90% B等度洗脱2 min。
质谱条件：AJS ESI 源，正离子模式。干燥气温度为325 ℃，干燥气流速为5 L/min，雾化气压力为45 psi，鞘气温度为 300 ℃，鞘气流速11 L/min，毛细管电压为3 500 V。对36 h时反应体系液褐变产物进行质谱分析。
1.2.9 基于分子对接技术的关键酶与底物亲合力预测
多酚氧化酶包括酪氨酸酶、儿茶酚氧化酶及漆酶。酪氨酸酶(EC 1.14.18.1，tyrosinase，TYR)是一种结构复杂的含多亚基的含铜氧化还原酶，也是调控黑色素生成的限速酶，广泛存在于微生物、动植物和人体中，这种酶参与黑色素合成可将单酚羟基化为二酚，将邻二酚氧化为邻二醌，邻二醌再反应后为黑色素，如马铃薯切片暴露在空气中出现变黑现象[16]。因此，本文以酪氨酸酶为关键酶分别与多酚类成分(没食子酸、儿茶素、表儿茶素)及蒽醌类成分(芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)进行对接。配体与受体可自发结合的条件为分子与靶标蛋白的最低结合能均小于0，参考相关文献[17]在PDB数据库中查找关键蛋白酪氨酸酶的PDB ID为：2Y9X，在Pubchem数据库查找活性小分子的2D结构(sdf格式)，采用Maestro 10.2软件进行对接。
2.1 大黄切面颜色
1～10号样在36 h内，颜色由棕黄色变为黑褐色(见图1)，表明大黄在鲜切晾干过程中发生酶促褐变导致大黄切面颜色变化明显。L*值从54.22变为28.91，a*值从18.48变为10.15，b*值从45.77变为20.72，总色度E*ab值从73.32变为36.98。(见表1)。实验结果也表明大黄在鲜切初期，其颜色及水分变化明显，后期逐渐减慢，这可能是因为鲜大黄体内含水量高新陈代谢活跃，其后在水分快速下降的同时，大黄机体启动抗干旱机制，促使酶活力降低，颜色变化缓慢。36 h后样品质量、水分及颜色均不发生明显变化，故以36 h为实验结点。
图1 大黄切面颜色
表1 各样品颜色色度值
2.2 各样品成分动态变化
由图2可知，不同晾干时间点的大黄样品色谱峰峰面积呈不同程度的减少。前30 min内各成分峰面积出现一定程度的增加，其后逐渐减少，这可能是因为组织细胞遭受机械破坏后，细胞内容物流出量增加导致各成分峰面积呈现短暂上升趋势，同时褐变关键酶与内容物相接触，在氧气的作用下，酶促褐变反应加快，有效成分减少，其后由于水分流失，大黄机体启动抗干旱机制，酶活力降低，有效成分变化缓慢。综上，大黄在此过程中样品色谱峰峰面积减少。
图2 1～10号样品色谱图
2.3 质谱分析结果
2.3.1 大黄样品正负离子模式
大黄样品在正负离子模式下的总离子流图示于图3。
图3 大黄样品正负离子模式下TIC图
2.3.2 大黄样品化学成分鉴定
以正离子模式下相对保留时间为1.83 min的m/z169.01的碎片离子为例，说明大黄样品中不同化合物的鉴定过程。m/z169.01碎片离子的 MS2光谱如图4A所示。根据m/z值计算得该化合物的可能元素组成为C7H6O5，在此基础上与整个数据库中的参考化合物进行比较，并将碎片离子m/z169.01、125.02及其相应强度与数据库中录入的参照化合物进行比较。根据上述化合物信息的对比分析，该化合物被鉴定为没食子酸，其裂解方式如图4B所示。
图4 正离子模式下没食子酸二级质谱图及裂解方式图
以正离子模式下相对保留时间为7.88 min的m/z269.05的碎片离子为例，说明大黄样品中不同化合物的鉴定过程。m/z269.05碎片离子的MS2光谱如图5A所示。根据m/z值计算得该化合物的可能元素组成为C15H10O5，在此基础上与整个数据库中的参考化合物进行比较，并将碎片离子m/z269.05、225.05及其相应强度与数据库中录入的参照化合物进行比较。根据上述化合物信息的对比分析，该化合物被鉴定为大黄素，其裂解方式如图5B所示。参照上述大黄素鉴定方法，其他化合物的鉴定结果见表2。
图5 正离子模式下大黄素二级质谱图及大黄素裂解方式图
表2结果所示，大黄样品中共鉴定出30种化合物，主要包括酚酸类、蒽醌类、黄烷醇类以及其他类。
表2 化合物鉴定及数据归属
2.4 反应体系颜色
由图6可知，粗酶液与没食子酸反应前后颜色变化明显，如图6A，从黄棕色变为黑褐色，表明酶类与没食子酸发生褐变反应导致体系颜色明显变化。考虑到提取的粗酶种类复杂，因此，分别构建没食子酸与多酚氧化酶液及过氧化氢酶液的反应体系，以便对后续底物与产物消长情况进行分析。实验结果也表明在多酚氧化酶液反应体系中，体系液由近无色转变为黑褐色，反应至36 h后体系颜色呈黑褐色，如图6B；
同样过氧化氢酶液反应体系颜色变化如图6C所示。
图6 反应体系颜色
2.5 多酚氧化酶液与没食子酸反应分析
2.5.1 多酚氧化酶液与没食子酸反应的HPLC分析
由图7可知，反应0 min的HPLC谱图上只检测到了没食子酸成分的存在，如图7A，当反应体系在36 h没食子酸含量比0 min明显降低，并检测到新峰的出现，即为多酚氧化酶与没食子酸反应产生的新物质。如图7B。随着时间的延长，A1组因不存在多酚氧化酶且体系液中不发生酶促褐变反应，没食子酸含量在不同时间点几乎不变，而A0组中在不同的时间点没食子酸含量逐渐减少，36 h后基本检测不到没食子酸成分。结合图8得出，随着体系反应时间的延长，没食子酸峰面积从初始的2 801变为113.3，最终消耗殆尽，而产物的含量基本保持不变。因此，可以确定多酚氧化酶与没食子酸发生了酶促褐变促使整个反应体系颜色加深。
图7 反应体系HPLC图谱
图8 反应体系HPLC局部放大谱图
2.5.2 基于LC-MS技术分析多酚氧化酶液与没食子酸的氧化产物
对36 h的反应液进行初步分析发现，在36 h体系液有m/z130.20、200.20、304.00、418.80、585.10、701.30、814.50的物质(见图9)，表明反应体系发生了褐变反应且有新物质生成。
图9 质谱图
2.6 过氧化氢酶液与没食子酸的反应分析
2.6.1 过氧化氢酶液与没食子酸的HPLC分析
0 h的HPLC谱图上只检测到了没食子酸成分存在(见图10A)，反应36 h的谱图上没食子酸含量比0 h明显降低。如图10B，并检测到2个新峰的出现，即为过氧化物酶与没食子酸反应的新物质。实验结果也表明随着时间的延长，B1组因无过氧化物酶不发生酶促褐变反应，不同时间点没食子酸含量几乎不变，而B0组中没食子酸含量随着时间的延长逐渐减少，实验结果也表明没食子酸的峰面积从2 701降到152，最终消耗殆尽，而产物的含量基本不变。因此，过氧化氢酶与没食子酸发生了酶促褐变导致反应体系颜色变化明显。
图10 反应体系HPLC图谱
2.6.2 基于LC-MS技术分析多酚氧化酶液与没食子酸的氧化产物
对36 h的反应液分析发现，在36 h时体系液m/z130.20、200.20、304.00、418.80、531.50、585.10、701.30、814.50(见图11)。这说明反应体系发生了褐变反应且有新物质出现，也可能是酶促褐变反应是不断氧化的过程导致其褐变产物的物质结构及分子量不断发生变化的结果。
图11 质谱图
2.7 对接结果
对接结果如图12及图13所示，其更加直接反应了化合物与蛋白残基形成的氢键作用和疏水(堆积)作用。结果表明最低结合能均小于0，表示酪氨酸酶与没食子酸等可发生相互作用(见表3)。
图12 与酪氨酸分子对接2D图
图13 酪氨酸分子对接3D图
表3 与酪氨酸酶对接结果
中药材采收加工是药材品质形成的重要环节。大黄在采收加工过程中易遭受不同程度的机械破坏，使其有效成分含量、外观、颜色、水分、质量均发生显著变化[3]。实验结果表明，鲜大黄横切面呈黄色，其后颜色逐渐加深至黑褐色。色差仪测定结果表明L*、a*、b*及E*ab值变化明显。UPLC-MS/MS结果表明大黄主要含有酚酸类、蒽醌类、黄烷醇类以及其他类成分。分子对接结果也表明酪氨酸酶与多酚类及蒽醌类均具有强结合力，这也为后续从蒽醌类成分出发探究褐变机理提供了思路。结果表明大黄鲜切初期颜色变化明显，后期逐渐减慢，这可能是因为水分快速下降的同时，大黄机体启动抗干旱机制，其通过自身调节来适应干旱胁迫，进而促使酶促反应减弱，颜色变化缓慢，有效成分减少变慢[18]。实验结果也表明多酚氧化酶液、过氧化氢酶与没食子酸的体系颜色变化明显，底物没食子酸含量逐渐减少直至消失，并有新产物出现。鉴于此，后续可采用中药化学手段，采用制备液相分离制备褐变产物，并将分离的褐变产物采用核磁共振光谱及波谱手段确定化合物的结构。
酶促褐变包括多酚氧化酶及过氧化物酶，多酚类成分为过氧化物酶和多酚氧化酶主要褐变底物[19]。大黄含有多糖类成分、氨基酸类成分、酚酸类成分、蒽醌类等成分[1]，这为大黄发生酶促褐变反应提供了条件。大黄与菊花如同，富含酚酸类成分，在受到机械破坏后，酚类物质、酶及氧气三者相互接触发生褐变反应，颜色变化明显[15]。现有研究表明果蔬类及中药材在加工和储藏过程也易发生褐变反应，如富含没食子酸、儿茶素、表没食子、儿茶素等成分是苹果、梨、猕猴桃、马铃薯等发生褐变的主要底物[20]。目前，多酚氧化酶与过氧化物酶被认为是含多酚类物质的药材及蔬果发生褐变的主要原因。因此，在大黄的采收加工过程中，可通过抑制关键酶活性降低对底物成分的消耗，阻止酶促褐变现象的发生。多酚氧化酶又包括酪氨酸酶、儿茶酚氧化酶及漆酶，后续可分别以酪氨酸酶、儿茶酚氧化酶及漆酶为关键酶分别与底物没食子酸、儿茶素、表儿茶素、大黄素等物质反应，以中药化学手段最终鉴定产物结构，以推测褐变反应的可能机理[21]。本文从宏观角度采用色差仪量化大黄颜色，其次从化学成分峰面积变化角度出发说明大黄发生酶促褐变过程。综上，多酚氧化酶和过氧化物酶是引起褐变的主要反应，在大黄采收加工过程中可以抑制多酚氧化酶及过氧化物酶的活性，从而有效提升大黄药材的品质，同时也为其他富含酚类药材酶促褐变的控制提供思路。
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