尹丽颖 张元野 李荣田,* 何明良 王芳权 许扬 刘欣欣 潘婷婷 田晓杰 卜庆云 李秀峰,*
利用CRISPR/Cas9技术创制高效抗除草剂水稻
尹丽颖1张元野1李荣田1,*何明良2王芳权3许扬3刘欣欣4潘婷婷5田晓杰2卜庆云2李秀峰2,*
（1黑龙江大学 生命科学学院，哈尔滨 150080；
2中国科学院 东北地理与农业生态研究所，哈尔滨 150081；
3江苏省农业科学院 粮食作物研究所，南京 210014；
4东北林业大学 生命科学学院，哈尔滨 150040；
5黑龙江八一农垦大学 农学院，大庆 163319；
*通信联系人，email: lirongtian07@aliyun.com; email: lixiufeng@iga.ac.cn）
【目的】培育抗除草剂品种在水稻育种中具有重要意义。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以黑龙江优质粳稻品种为材料，编辑乙酰乳酸合酶基因，创制具有抗除草剂特性的水稻材料。【方法】利用CRISPR/Cas9技术，以乙酰乳酸合酶为靶基因，构建单碱基突变载体pH-nCas9-PBE-，以松粳22、龙粳46和绥粳18为转化材料，利用农杆菌介导转化获得转基因植株，通过对转基因植株的突变位点进行测序结合除草剂喷施试验，鉴定基因型及表型。【结果】经分子水平检测验证，获得S627N突变植株10株，S627N且1884G-A但第628位氨基酸未改变突变植株1株，S627N/G628E突变植株1株。相较于野生型，以上三类突变植株均具有较强抗除草剂特性。【结论】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得具有抗除草剂特性，能够稳定遗传，不含转基因标记的纯合株系，可为抗除草剂水稻育种提供基础材料。
水稻；
乙酰乳酸合酶；
抗除草剂；
咪唑乙烟酸；
CRISPR/Cas9；
基因编辑
当前世界人口急剧增长，粮食不足成为制约人均生活水平的主要难题[1]。水稻作为主要粮食作物之一，稻田杂草泛滥是增产的重要限制因素，选育和创制抗除草剂品种具有很大的发展空间[2]。草害是影响水稻产量的重要因素之一，杂草与作物竞争水、阳光、土壤等生存资源的同时，抑制植株生长、结实，降低稻谷品质、产量，造成严重经济损失[3]。随着城镇化速度的加快，传统农业面临极大挑战，人工除草、机械除草、物理除草等因耗时费力逐渐被化学除草取代，化学除草现已成为控制草害的主要手段[4]。化学除草能够有效减少作物产量损失、降低人力成本，然而化学除草剂在杀伤杂草的同时，也会对作物产生不良影响，造成水稻减量降低、稻米品质变差[5]，因而培育抗除草剂水稻品种尤为重要。
世界上第一种商品化转基因水稻为抗除草剂水稻[6]。随着技术发展，传统育种技术已不能满足现代需求。作为新一代的基因编辑技术，CRISPR/Cas9技术可进行定向基因编辑改造[7]，在作物育种改良中应用广泛。在水稻育种研究中，该技术因简单高效而被大量使用，已有研究利用该项技术改良水稻熟期[8]、香味[9]、直链淀粉含量[10]及粒型[11]等多个性状。
不同的化学除草剂具有不同的杀草谱，化学除草剂与相应的抗除草剂水稻品种联用控制草害效果较好[12]。目前抗除草剂类型有咪唑啉酮类、磺酰脲类、环己烯酮类、有机磷类、均三氮苯类和激素类等6大类[13]。咪唑啉酮类除草剂在实际生产中应用广泛，包括咪唑烟酯、咪唑乙烟酸、咪唑喹啉酸、甲氧咪草烟、甲基咪草烟和咪草酸[14]。这是一类广谱除草剂，通过与靶标酶乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase，）结合[15]，抑制其活性，破坏植物体内缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的合成[16]，最终导致植物死亡，进而达到除草的目的。抗抑制剂水稻品种具有较大的研究价值，国外学者首先获得了抗抑制剂水稻品种[17]。美国科学家通过抗性筛选选育出CL141 和 CL121两个品种，已在2001获得批准大量种植[18]，至2011年，抗抑制剂类水稻（抗咪草烟）已占美国水稻种植总数的50%[19]。研究显示，至少有20个氨基酸突变位点导致植物对抑制剂类除草剂产生抗性[15]，在黄华占、华航31、金粳818、镇稻18等水稻品种中，通过EMS诱变或自然变异均成功获得了抗抑制剂类突变植株[21-24]。
随着农业供给侧改革的推进，黑龙江地区作物生产模式逐步向轻简栽培发展，直播稻成为一种重要的发展方向，田间草害是直播稻发展的重要限制因子，除草剂成为现代农业中常用防治杂草的手段之一[25]。为进一步丰富黑龙江抗除草剂水稻种质，本研究利用CRISPR/Cas9技术，以黑龙江优质粳稻品种松粳22、龙粳46和绥粳18为研究材料，对基因进行单碱基编辑，以期基因第627位氨基酸由丝氨酸突变为天冬酰胺，从而使水稻材料具有除草剂抗性，为深入开展水稻抗除草剂育种奠定材料基础。
1.1 试验材料
本研究以粳稻松粳22、龙粳46和绥粳18为试验材料，获得基因编辑植株，并在哈尔滨（北纬45°）种植，行株距为以25 cm×25 cm，自然长日照条件下生长。
试验所用载体pZHW-OsU3和pH-nCas9-PBE为中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究组开发并拥有自主知识产权，由江苏省农业科学院杨杰研究员惠赠。
1.2 CRISPR/Cas9靶点接头设计及载体构建
通过NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获得（LOC_Os02g30630）的基因序列，利用CRISPR-GE在线网站（http://skl.scau.edu.cn/），在第1外显子（图1）设计1对靶点接头引物CAS9-ALS-LP/RP（表1），利用软件“CRISPR Primer Designer”比对水稻全基因组序列，检测靶点的特异性，排除潜在脱靶序列。
参照Li等[26]的方法进行载体构建，将连接好的载体通过热激法转入大肠杆菌TOP10中，菌液PCR检测后，选取阳性菌落摇菌后提取质粒。利用测序公共引物M13-F对载体质粒进行PCR，对PCR产物进行测序，通过热激法将检测无误的质粒转入EHA105农杆菌感受态细胞中。
表1 本研究中所用的引物
1.3 T0代阳性植株的获得
通过农杆菌介导法，将CRISPR/Cas9表达载体pH-nCas9-PBE-转入松粳22、龙粳46和绥粳18的愈伤组织中，经过潮霉素筛选抗性愈伤组织，分化获得T0代植株。将T0代植株种植于室外盆栽盒中，对每株T0代植株提取叶片的全基因组DNA，通过引物HPT-F/R(表1)进行PCR检测，产物大小为900 bp的植株即阳性转基因植株。同时，利用测序引物ALS-F/R(表1)进行PCR，将产物送吉林省库美生物科技有限公司进行测序，将阳性转基因植株种植于盆栽盒中，收获种子用于下一代种植。
黑色序列为靶点序列，下划线序列为PAM序列。
Fig. 1. Gene structure and target site of
1.4 T1代纯合突变植株的筛选
在T0代收获的种子中，挑选粒型饱满的种子，室温浸种1 d，37℃下催芽1 d，种植于室外盆栽盒中，在苗期提取T1代植株基因组DNA，利用潮霉素引物HPT-F/R鉴定，选择不含有潮霉素标记的植株继续加代。同时利用测序引物ALS- F/R(表1)进行PCR扩增，产物送吉林省库美生物科技有限公司进行测序，挑选编辑成功且编辑位点纯合的植物进行种植。
1.5 T2代植株性状分析
依据测序结果，选择T2代植株与野生型植株种植于室外盆栽场45 cm×85 cm盆栽盒中，于4叶期时，按照0.1 mL/m2喷施10%咪唑乙烟酸（山东先达农化股份有限公司，先达豆说好10%咪唑乙烟酸水剂）。3 d后观察植株生长情况，对比T2代植株与野生型植株的抗药性，15 d后统计成活率。
同时，将T2代植株与野生型植株分为三组种植于盆栽盒中，喷施农业中常用其他种类除草剂作耐药性研究，包括甲嘧磺隆（江苏瑞邦农药厂有限公司，瑞邦绿无影75%甲嘧磺隆可湿性粉剂）、氯吡嘧磺隆（江苏省农用激素工程技术研究中心有限公司，巨禾75%氯吡嘧磺隆水分散粒剂）和双草醚（安徽蓝田农业开发有限公司，蓝田农美保10%双草醚悬浮剂），待植株生长至4叶期，选用适当浓度喷施除草剂，3 d后观察植株生长情况。
2.1 T0代转基因阳性苗检测
水稻基因编码区序列全长为1935 bp，编码644个氨基酸[27]。根据以往研究，在1880 bp处碱基G突变为A后，第627位氨基酸由丝氨酸突变为了天冬酰胺，能够使植株获得抗咪唑啉酮类抗性[28]，据此设计CRISPR/Cas9引物，并构建载体pH-nCas9-PBE-，利用农杆菌转化法侵染松粳22、龙粳46和绥粳18的愈伤组织，获得转基因植株T0代，对获得的21株转基因植株进行潮霉素鉴定及测序。其中19株为阳性植株，2株为阴性植株，阳性率为90.5%（图2）。对T0代植株进行测序发现（图3），靶点附近出现较多套峰，编辑材料多为杂合，可在下一代植株进一步测序筛选。因环境因素导致部分T0代植株结实率低，最终收获12株T0代植株的种子。
M―DM2000 DNA 标记; 1―阴性对照; 2―阳性对照; 3～23―T0代植株。
M, DM2000 DNA Marker; 1, Negative control; 2, Positive control; 3−23, T0generation plants.
图2 T0代植株转基因检测
Fig. 2. Transgenic detection of T0generation plants.
图3 T0代转基因植株测序结果
Fig. 3. Sequencing results of T0generation transgenic plants.
2.2 T1代植株突变类型检测
将T0代收获的种子继续种植，根据PCR检测结果筛选出剔除潮霉素基因的植株种植到室外盆栽场，鉴定结果如图4所示。
12水稻株系中，有10个株系（SJ22-1、SJ22-2、SJ22-3、SJ22-4、LJ46-1、LJ46-2、LJ46-4、SJ18-1、SJ18-2、SJ18-3）在1880 bp处碱基G突变为A，即627位氨基酸由丝氨酸突变为了天冬酰胺（S627N）。SJ18-4在1880 bp处碱基G突变为A的情况下第1884 bp处碱基G突变为A，但氨基酸没有发生改变（S627N且1884G-A）。另外，LJ46-3除第1880 bp处碱基G突变为A外，在第1883―1884 bp处还存在碱基GG变为AA的突变，导致第628位甘氨酸变为谷氨酸（S627N/G628E）（图5）。
2.3 T2代植株抗性分析
将T2代编辑植株与野生型松粳22、龙粳46和绥粳18种植在与盆栽场相同的环境中，生长40 d后，喷施10%的化学除草剂咪唑乙烟酸，3 d后观察其生长情况。在喷施除草剂3 d后，野生型松粳22、龙粳46和绥粳18的各个株系均出现明显的叶片干枯、黄化、生长停滞等现象（图6），且在喷施咪唑乙烟酸后15 d内逐渐死亡（表2），而12种突变体在喷施除草剂15 d后仍能够正常生长，叶片无干枯、黄化现象，具有很强的抗除草剂能力，且田间无杂草生长，证明基因编辑抗除草剂植株与相应化学除草剂联用能够充分解决草害问题。
图4 T1代转基因植株测序结果
Fig. 4. Sequencing results of T1generation transgenic plants.
为进一步研究编辑材料对除草剂的抗性，在农业生产中使用频率较高的除草剂中，选择三种除草剂（甲嘧磺隆、氯吡嘧磺隆、双草醚）进行广谱抗性研究。经梯度浓度喷施测试后，根据表型选择合适浓度进行喷施，其结果如图7。在氯吡嘧磺隆处理组中，喷药3 d后，各编辑材料叶片微微变黄，但在后续观察中发现，编辑材料生长良好，而野生型植株叶片发黄，干枯皱缩，逐渐死亡；
在甲嘧磺隆处理组中，喷药3 d后，植株生长情况与氯吡嘧磺隆组类似，在绥粳18背景的材料中，野生型叶片迅速发黄干枯，而编辑材料正常生长，叶片微微发黄；
在双草醚处理组中，喷药2 d后，全部植株叶片发黄，3 d后，植株均出现较大程度的干枯皱缩，但相对于野生型，编辑材料生长能力较强。虽在不同除草剂处理情况下，各背景下的编辑材料表现出不同的抗性，但相较于野生型，表现出一定的抗性，证明本研究选用的三种材料，在对基因进行编辑过后，对其他类除草剂的抗性有所增强。
图5 T1代转基因植株氨基酸突变类型
Fig. 5. Amino acid mutation of the target gene of T1generation transgenic plants.
图6 T2代除草剂抗性鉴定（标尺=10 cm）
Fig. 6. Herbicide resistance identification of T2generation (Bar=10 cm).
图7 T2代农用除草剂抗性鉴定（标尺=10 cm）
Fig. 7. Resistance identification of T2generation to herbicides for agricultural use (Bar=10 cm).
本研究利用CRISPR/Cas9技术，以黑龙江优质粳稻品种松粳22、龙粳46和绥粳18为研究材料，对基因进行定点突变，获得具有良好除草剂抗性的水稻材料。相较于传统育种技术，在育种速度及精度上有很大的提高，而且相较于诱变育种以及自然变异等需大量精力筛选材料的方法，CRISPR/Cas9技术存在极大的高效优势。
表2 喷施除草剂咪唑乙烟酸后T2代植株存活率调查
CK―正常生长40 d的成苗数量; 3 d―喷施咪唑乙烟酸3 d后黄化苗数量; 15 d―喷施咪唑乙烟酸15 d后的成苗数量; 存活率―喷施咪唑乙烟酸存活率。
CK, Number of seedlings after 40 days of growth under normal conditions; 3 d, Number of etiolated seedlings 3 days after imidazole ethylnicotinic acid spraying; 15 d, Number of living seedlings 15 days after imidazole ethylnicotinic acid spraying; Survival rate, Survival rate of seedlings after imidazole ethylnicotinic acid spraying.
根据突变位点和类型的不同，植物基因突变后，可以分别获得抗咪唑啉酮类、磺酸脲类和嘧啶硫代苯甲酸酯类等除草剂的能力，但单一位点突变后，往往只具有对一种类型除草剂的抗性[29]。在目前的水稻生产中，单一突变基因作物还未暴露出更大的缺陷，依然能够应付一定剂量此类型除草剂，但是杂草存在产生除草剂抗性的可能，因而抗除草剂作物育种不能停滞。
在本研究中，除10个成功突变预期位点的株系外，还获得了两种不同类型的转基因株系（SJ18-4、LJ46-3），SJ18-4的第1884 bp处碱基G突变为A，但氨基酸没有发生改变。而LJ46-3第1883－1884 bp处碱基同样发生了突变，碱基GG变为AA，导致第628位甘氨酸变为谷氨酸。在以往的研究中，有报道G628W的突变类型[30]，突变后具有抗咪唑啉酮类抗性。类似地，G628E突变后同样具有抗咪唑啉酮类除草剂的能力，且627、628双位点突变后，除草剂抗性能够提升约30%[31]，具有S627N/G628E突变的LJ46-3株系，是否能够获得除抗咪唑啉酮类以外除草剂的抗性或更强的咪唑啉酮类抗性目前尚不清楚，根据测序结果仅LJ46-3为杂合植株，可在后续加代中获得纯合植株后继续进行研究。在对其他三种除草剂的抗性研究中发现，在基因突变后，喷施超额剂量的除草剂后，LJ46-3植株能够一定程度正常生长，证明对其他除草剂抗性也部分增强。本研究中获得的双位点突变材料LJ46-3，具有较强的除草剂抗性，有望进一步培育为优质抗除草剂材料。抗除草剂品种仍是育种者的目标，本研究可为抗除草剂的研究提供一定的数据参考。
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Improvement of Herbicide Resistance in Rice by Using CRISPR/Cas9 System
YIN Liying1, ZHANG Yuanye1, LI Rongtian1,*, HE Mingliang2, WANG Fangquan3, XU Yang3, LIU Xinxin4, PAN Tingting5, TIAN Xiaojie2, BU Qingyun2, LI Xiufeng2,*
(1College of Life Science, Heilongjiang University, Harbin 150080, China;2Northeast Institute of Geography and Agroecology, Key Laboratory of Soybean Molecular Design Breeding, Chinese Academy of Sciences, Harbin 150081, China;3Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;4College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China;5College of Agriculture, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China;*Corresponding author, email: lirongtian07@aliyun.com; lixiufeng@iga.ac.cn)
【Objective】It is of great significance to create herbicide-resistant rice varieties. The acetyllactic acid synthase () gene was edited to create rice varieties with excellent herbicide resistance using non-herbicide-resistantrice varieties with good quality as materials. 【Methods】Using CRISPR/Cas9 technology, the single-base mutant vector pH-NCas9-PBA-was constructed with acyllactic acid synthase () as the target gene. Songjing 22, Longjing 46 and Suijing 18 were used as transformation materials to obtain transgenic plants through-mediated genetic transformation. Genotypes and phenotypes were identified by sequencing the mutation sites of transgenic plants and herbicide spraying test. 【Results】 TenS627Nmutants, oneS627Nand1884G-A(the 628thamino acid unchanged mutant), and oneS627N/G628Emutant were obtained by molecular level detection. Compared with the wild type, the three types of mutants had stronger herbicide resistance.【Conclusion】Using CRISPR/Cas9 gene editing technology, we obtained homozygous mutant lines which are genetically stable and herbicide-resistant, providing basic materials for herbicide-resistant rice breeding.
rice;; herbicide resistance; imazethapyr; CRISPR/Cas9; gene editing
10.16819/j.1001-7216.2022.211004
2021-10-13;
2021-12-07。
黑龙江省杰出青年基金资助项目(JQ2020C003)。
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