郑荣佳， 孔维一*， 冯嘉欣， 郑轶琦， 叶 刚， 沈泽宇， 刘建秀， 郭海林*
(1. 江苏省中国科学院植物研究所南京中山植物园， 江苏 南京 210014；
2. 河南科技大学， 河南 洛阳 471000)
结缕草属植物(ZoysiaWilld.)是禾本科(Gramineae)画眉草亚科(Eragrostoideae)的多年生C4型草本植物。我国具有丰富的结缕草属种质资源，主要存在5个种、2个变种和1个变型，其中5个种为日本结缕草(Zoysiajaponica)、中华结缕草(Zoysiasinica)、大穗结缕草(Zoysiamacrostachya)、沟叶结缕草(Zoysiamatrella)和细叶结缕草(Zoysiatenuifolia)[1]。结缕草属植物具有耐践踏、耐高温、易养护等特点，是世界上公认的优良暖季型草坪草[2]，可广泛应用于观赏草坪、休憩草坪、运动草坪以及保土草坪。
我国结缕草属种质资源分布范围较广，适应性强，能生存于盐碱地和荒漠等环境。由于极端生长条件的选择压力，以及常异花授粉特性，结缕草属植物存在丰富的形态和遗传变异[3]。Yaneshita等[4]和李亚等[5]分析了结缕草属植物的形态多样性，Lee等[6]、Hidenori等[7]和Moore等[8]则利用分子标记研究了结缕草属植物的遗传多样性。开展物种表型多样性研究有利于鉴别特异性种质资源，为挖掘植物优良基因和新品种选育奠定理论基础[9-11]。在结缕草育种中，坪用性状受到广泛研究。单旭东等[12]研究发现保温浇水处理可以明显推迟结缕草的枯黄期，延长其青绿期。马雪梅等[13]研究发现不同程度的践踏胁迫显著地影响结缕草草坪的坪用性状，适度践踏可控制草层高度，增加草坪密度。然而有关结缕草种子产量性状的研究并不多。Matumura等[14]研究指出，相比于日本南方地区，日本结缕草在北方地区生产的种子产量更高。马春晖等[15]研究不同生境对结缕草种子产量的影响，发现阳坡结缕草种子的产量明显高于平地与阴坡。董厚德等[16]发现我国辽宁地区结缕草的种子产量明显高于山东。郭海林等[17]通过研究68个结缕草杂交后代的繁殖性能，选育出2个坪用质量高且生长速度快的品系，以及3个种子产量高的品系。
结缕草属植物既可营养繁殖又可种子繁殖。我国自主培育的结缕草品种主要为营养繁殖型，仅有青岛结缕草为种子繁殖型。种子繁殖相对于营养繁殖具有生产成本低、草坪建植方便、运输便利等诸多优点。随着结缕草需求量日益增大，迫切需要培育优质高产的种子繁殖型新品种。江苏省中国科学院植物研究所收集了国内外大量的结缕草属种质资源，并通过杂交选育获得一系列具有优良性状的杂交后代。本研究以具有种子生产潜力的日本结缕草、中华结缕草、大穗结缕草种质资源和一些优异的杂交后代为试验材料，通过对其营养性状和生殖性状进行观测评价和遗传变异分析，筛选出坪用质量高和种子产量高的特异性种质，为高产优质结缕草新品种的杂交育种提供骨干亲本。
1.1 试验材料
供试材料为144份结缕草属种质资源，包含125份种源材料和19份杂交后代。125份种源材料细分成79份日本结缕草、37份中华结缕草、4份大穗结缕草、5份天然杂交结缕草，这些资源中109份为从国内收集的野生资源，其中江苏(30份)、山东(21份)、安徽(19份)、浙江(14份)、辽宁(5份)、重庆(5份)、福建(4份)、河南(3份)、上海(3份)、北京(2份)、海南(1份)、湖南(1份)、江西(1份)，16份从国外引进，分别为日本(2份)、美国(6份)、朝鲜(8份)。19份杂交后代是本单位利用日本结缕草、中华结缕草、大穗结缕草、沟叶结缕草和长花结缕草(Zoysiasinicavar.nipponica)通过杂交选育获得。具体材料信息见表1。
表1 供试的144份结缕草属种质资源信息Table 1 Information of 144 Zoysia germplasm resources
续表1
1.2 试验地概况
试验地位于江苏省中国科学院植物研究所草业研究中心苗圃中(32°01′N，118°48′E)，属于北亚热带季风气候，年平均气温为15.4℃，年最高气温为36℃，最低气温为零下9℃。气候温和，年平均降水量为1 013 mm，降水集中于6—9月。试验材料种植采用盆栽法，基质为试验地沙质土壤，肥力中等。2019年夏季取相同数量的草茎均匀种植于试验地的花盆(高和直径为26 cm)，每份材料设置2个重复。所有材料统一进行水肥管理、杂草清除及病虫害防治，待草坪完全成坪后用于后续试验。
1.3 性状测定
本试验于2021年5月至11月期间进行10个营养性状和12个生殖性状的测定。测定方法参考《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南结缕草属》[18]，并适当补充和调整，具体如下：草层高度：植物生长的自然高度，重复10次；
草层密度：5 cm×6 cm小框内直立枝数目，重复3次；
叶长和叶宽：直立茎从上往下第3片叶的长度和中部宽度，重复10次；
叶片上表面和下表面茸毛密度：1为无或极疏，2为疏，3为密；
叶舌纤毛密度：1为无或极疏，2为疏，3为密；
叶色：1为浅绿色，2为绿色，3为深绿色，4为灰绿色；
地下茎节间长度和直径：地下茎第4个节的长度和中部宽度，重复10次；
生殖枝高度：从地表到花序顶部的自然高度，重复10次；
花序密度：5 cm×6 cm小框内花序的数目，重复5次；
花序长度和宽度：花序基部小穗到顶端的长度和花序中部宽度，重复10次；
穗颈长：旗叶到花序基部小穗的长度，重复10次；
每穗小穗数：整个花序的小穗数目，重复10次；
小穗长和小穗宽：花序中部小穗的长度和宽度，重复10次；
小穗柄长：小穗基部与花序轴之间小穗柄的长度，重复10次；
小穗形态：1为披针形，2为卵状披针形，3为长卵形，4为卵形；
小穗柄形态：1为直，2为弯；
千粒重：随机取100粒烘干的种子，用千分之一电子天平称重，5个重复，取平均数后换算为1 000粒种子的重量。
1.4 数据处理
利用Excel 2016软件对最大值、最小值、平均数、标准差进行计算，变异系数CV(%)=(标准差/平均数)×100%。用SPSS 19.0软件计算Shannon多样性指数[H′=-∑PilnPi](Pi为某性状第i个品种出现的频率)[19]，并进行主成分分析和聚类分析。
2.1 结缕草属植物不同表型性状之间遗传变异分析
对144份种质资源的22个表型性状进行变异分析，结果如表2所示，结缕草属植物各性状在不同材料之间具有广泛的变异，且不同性状的变异程度不同。生殖性状中变异系数最大的2个性状是穗颈长和花序密度，分别为61.48%和48.33%；
其次为小穗柄形态、千粒重、小穗形态、每穗小穗数、生殖枝高度、小穗柄长、小穗长、花序长，它们的变异系数都大于20%；
变异系数最小的2个性状为花序宽和小穗宽，分别为16.62%和13.90%。营养性状中变异系数最大的2个性状是叶片上表面茸毛密度和草层密度，分别为47.41%和44.83%；
地下茎节间直径的变异系数最小，为15.40%；
其他营养性状的变异系数处于两者之间。由此可见，结缕草属植物表型性状的变异程度较大，尤其是穗颈长、花序密度、叶片上表面茸毛密度和草层密度这4个性状。在育种改良过程中参考这些变异大的表型性状，有利于筛选结缕草属植物中的优异种质。
遗传多样性指数可以反映植物表型性状的遗传多样性[20]。由表2可知，22个表型性状的Shannon多样性指数有较大差异，其变化范围为0.40～4.95，平均值为3.51，说明结缕草属植物表型性状的遗传多样性较丰富。12个生殖性状按多样性指数从大到小排序为穗颈长(4.86)>生殖枝高度(4.84)>每穗小穗数(4.73)>小穗柄长(4.56)>花序长(4.51)>千粒重(4.45)>小穗长(4.41)>花序宽(4.30)>花序密度(3.82)=小穗宽(3.82)>小穗形态(1.65)>小穗柄形态(0.62)。10个营养性状按多样性指数从大到小排序为叶长(4.95)>草层高度(4.79)=草层密度(4.79)>叶宽(4.68)>地下茎节间长度(4.55)>地下茎节间直径(4.22)>叶色(1.17)>叶片上表面茸毛密度(0.75)>叶舌纤毛密度(0.42)>叶片下表面茸毛密度(0.40)。由此可见，生殖性状中穗颈长的遗传多样性指数最高，而营养性状中叶长的遗传多样性指数最高。
表2 结缕草属植物表型性状遗传变异分析Table 2 Genetic variation analysis of phenotypic traits of Zoysia
2.2 结缕草属不同种之间遗传变异分析
按照结缕草属的不同种类进行遗传变异分析，结果如表3所示，与其他种相比，日本结缕草的草层密度、叶片上下表面茸毛密度的变异系数最大，但花序密度、每穗小穗数、千粒重、叶长、叶色和地下茎特征的变异系数均最小；
中华结缕草的各性状表现都比较中等；
大穗结缕草的花序密度、每穗小穗数、叶色和地下茎节间直径变异系数最大；
然而杂交结缕草大部分性状的变异系数都比较大。按所有性状的平均变异系数从大到小的排序为：杂交结缕草(37.15%)>中华结缕草(30.39%)>日本结缕草(29.17%)>大穗结缕草(25.63%)。通过分析结缕草属不同种的Shannon多样性指数发现，日本结缕草的平均多样性指数最高，为3.11；
大穗结缕草的多样性指数最低，为1.04。这结果表明日本结缕草的性状多样性最为丰富，最可能从中筛选出性状优良的育种材料。
2.3 结缕草属植物表型性状的主成分分析
通过主成分分析将结缕草属植物22个表型性状集中于5个主成分，累计贡献率为67.32%(表4)，这表明各性状的贡献率分散，累积贡献率增长不明显，反映出性状变异的多向性。由表4可知，第1主成分的特征值为6.09，贡献率为27.67%，其中叶长、叶宽、花序长、花序宽特征向量的绝对值较高，说明第1主成分主要反映叶片和花序特征因子；
第2主成分的特征值为3.65，贡献率为16.60%，其中小穗形态、小穗长特征向量的绝对值较高，所以称为小穗特征因子；
第3主成分的特征值为2.11，贡献率为9.59%，地下茎节间长度、地下茎节间直径特征向量的绝对值较高，二者属于地下茎特征因子；
第4主成分的特征值为1.63，贡献率为7.39%，生殖枝高度、穗颈长特征向量的绝对值较高，二者均为高度特征因子；
第5主成分的特征值为1.33，贡献率为6.06%，叶片上表面茸毛密度、叶片下表面茸毛密度特征向量的绝对值较高，可称为叶片被毛特征因子。
表3 结缕草属植物不同种表型性状遗传变异分析Table 3 Genetic variation analysis of phenotypic traits among four Zoysia species
表4 结缕草属植物表型性状的主成分分析Table 4 Principal component analysis of phenotypic traits of Zoysia
2.4 结缕草属种质资源聚类分析
聚类分析表明，在欧式距离为3.5处，144份结缕草属种质资源可分成4个类群(图1)，其性状平均值和变异系数见表5。第Ⅰ类群共86份材料，包含42份日本结缕草、29份中华结缕草、11份杂交新品(种)系、3份大穗结缕草和1份自然杂交结缕草。这一类群可细分为A、B两个亚类群，A亚类群主要表现为花序密度高、每穗小穗数和千粒重较高、草层高且密、地下茎节间长又宽，可用于选育种子繁殖型品种，也可进行营养繁殖用于固土护坡。而B亚类群的主要特点为每穗小穗数高、千粒重最大。第Ⅱ类群共30份材料，大部分是日本结缕草，还有2份中华结缕草，主要特点为每穗小穗数最高、千粒重大、小穗卵形、小穗柄弯曲、叶片长而宽、叶片较粗糙、叶色较绿、草层密度最低，适合选育种子繁殖型品种。第Ⅲ类群共25份材料，包含9份日本结缕草、8份杂交结缕草、5份中华结缕草、2份自然杂交结缕草和1份大穗结缕草。这一类群的多数性状表现居中，属于中间类型材料。第Ⅳ类群包含3份材料(Z097，Z164和Z168)，其主要特点为花序密度最高、生殖枝高度最矮、花序短而窄、每穗小穗数和千粒重最小、草层低矮浓密、叶片较光滑、叶色深绿，可作为优良亲本选育坪用型品种用于公园和小区等绿化。此外，4个类群的性状没有表现出明显的地域特征。
图1 供试的144份结缕草属种质资源的聚类图Fig.1 Cluster diagram of 144 Zoysia germplasm resources
表5 结缕草属植物4个类群表型性状特点Table 5 Phenotypic characters of four Zoysia groups
2.5 优质高产种质资源筛选
根据花序密度、每穗小穗数和千粒重筛选具有种子生产潜力的优异种质，发现Z039，Z052，Z101，Z107，Z117，Z136，Z145，Z156，Z157，Z158，Z159，Z169具有高的花序密度和每穗小穗数以及较高的千粒重。这12份材料的花序密度变异范围为9.20～16.40个·(30 cm)-2，除Z039外其他材料的花序密度都大于10.00个·(30 cm)-2；
其每穗小穗数变异范围为24.40～51.90个，除Z107外其他材料的每穗小穗数均大于30个；
其千粒重变异范围为0.54～0.96 g，以上3个指标值均在所有材料中位居前列。根据草层高度、草层密度和叶色筛选坪用质量优异种质，发现Z007，Z097，Z143，Z164，Z168和Z0419-8具有草层低矮浓密，叶色深绿等特征，这6份材料的草层高度变异范围为6.14～6.80 cm，在所有材料中排名前20位；
其草层密度变异范围为134.33～192.33个·(30 cm)-2，在所有材料中排名前10位；
其叶色变异范围为2.00～2.50，叶色表现为绿色或深绿色。
种质资源遗传变异研究是遗传改良的基础，是新品种选育的关键[21]。结缕草属植物分布广泛，由于复杂的环境、长期的地理隔离和自然选择，使结缕草属植物表型性状存在丰富的遗传变异[22]。表型性状是基因与环境互作的表现形式，在内部基因遗传的基础上反应植物对环境的适应性，是研究植物遗传变异最有效、最直接的指标[23-24]。研究结缕草属植物表型多样性，既可以根据不同性状的变异幅度了解该物种特有的遗传特性，还有助于挖掘控制重要性状的优异基因，培育优良的坪用型和种子高产型新品种[25]。
3.1 结缕草属植物表型多样性
本研究通过调查结缕草属植物144份材料的22个性状，发现所有性状的变异系数均大于10%，表明结缕草属植物的表型性状遗传差异大，变异丰富，其中花序密度、穗颈长、草层密度和叶片上表面茸毛密度变异系数最高，因而对这些性状的遗传改良空间较大。刘建秀等[26]研究也发现中华结缕草种内形态变异很大，其中形态指数的变异系数最大，高至41.5；
其次为草层高度、叶色及叶长，变异系数为22.2～22.6。刘建秀等对结缕草种质资源结实性研究中发现，与种子产量相关的3个主要性状的变异系数从大到小为花序密度>千粒重>每穗小穗数[27]。本研究也发现了相同的结果，表明花序密度的变异系数最大，最有利于育种者进行遗传改良。在营养性状中，所有营养性状的变异系数都大于10%，其中草层密度的变异系数最大，达到44.83%，这些丰富的性状变异为选育优质坪用型结缕草提供可能。
本研究还对结缕草属植物表型性状的Shannon多样性指数进行了分析，平均遗传多样性指数为3.51，调查的22个性状中仅4个性状的多样性指数小于1，表明结缕草属植物表型性状存在丰富的多样性。综合比较分析结缕草属植物的变异系数和多样性指数，发现相同性状的变异系数和多样性指数结果不完全一致，如叶片上表面茸毛密度变异系数为47.41%，与其它性状相比变异系数较大，但多样性指数只有0.75，与其它性状相比多样性指数较低。郑轶琦等[28]通过遗传变异系数和多样性指数对狗牙根(CynodondactylonL.)遗传多样性进行分析，也发现了狗牙根的叶腹面毛与小穗长度这2个性状的变异系数和多样性指数表现不完全一致，这可能是因为变异系数反应的是性状的变异程度[29]，而多样性指数反应的是性状多样性的丰富程度[30]。因此，通过变异系数和多样性指数从不同的角度分析结缕草属植物表型性状的遗传差异和多样性，更加全面地解析了结缕草属植物表型性状的遗传变异特性。
3.2 结缕草属植物种间遗传变异
日本结缕草、中华结缕草、大穗结缕草、杂交结缕草四个种的表型性状遗传变异都很丰富，其中杂交结缕草的平均变异系数最大，种内性状变异丰富，这与杂交结缕草均为不同种之间的杂交后代有关。中华结缕草的平均变异系数大于日本结缕草，表明中华结缕草种内表型性状存在更大的变异，李亚等[31]对结缕草及中华结缕草种内的性状变异进行研究，发现中华结缕草的种内变异较日本结缕草大，尤其在生殖枝高度、小穗密度和花序柄长度等性状上更加明显。日本结缕草的平均Shannon多样性指数最高，表明种内性状多样性丰富。其中大穗结缕草变异系数和Shannon多样性指数都是最低的，可能与其研究材料较少有关。
3.3 结缕草属植物表型性状主成分特征
本研究对结缕草属植物22个性状进行主成分分析，根据特征值大于1的原则选取5个主成分，累计贡献率达到67.32%，基本能反映全部指标的绝大部分信息，表明这5个成分是影响结缕草属植物多样性的主要因素，可分为叶片和花序特征、小穗特征、地下茎特征、高度特征和叶片被毛特征因子。本研究中前3个主成分的累计贡献率达到53.87%，这与金洪[32]对结缕草属植物12个性状主成分分析的结果存在一定差别，其研究中前3个主成分的累计贡献率达到84.89%，仅第1成分的贡献率就达到了59.16%，可能是因为种质群体和性状指标不相同导致的。主成分分析可以将大量的性状指标浓缩为少数综合因子，用少数的变量因子代表所有的变量信息[33]。本研究确定了叶片和花序特征、小穗特征、地下茎特征、高度特征(生殖枝高度和穗颈长)和叶片被毛特征因子，可为结缕草属育种中合理选配亲本及品种评价中快速选择评价指标提供理论依据。
3.4 结缕草属种质资源聚类特点
聚类分析能够体现结缕草属植物种质材料间的亲缘关系，根据性状聚类特点，育种者可以从不同类群中筛选出具有突出性状的材料进行杂交育种，选育出优良的新品种[34]。基于本文聚类分析结果，144份材料并没有完全按照种的划分进行聚类，如第Ⅰ类群和第Ⅲ类群都分别包含了日本结缕草、中华结缕草、大穗结缕草和杂交结缕草。郭海林等[35]利用两种分子标记对结缕草属植物的遗传多样性进行研究，也发现结缕草属植物不同种之间有交叉聚类的现象。出现这种情况可能与结缕草属植物异花授粉的特性有关，结缕草属植物雌蕊先熟雄蕊后熟，自花结实率低，长期进化过程中，不同种以及同一种的不同种源间会发生基因漂流现象，不同种之间可进行天然杂交，在表型形态上表现出连续变异的现象。在性状特征上，第Ⅰ类群中A亚类的花序密度高、每穗小穗数和千粒重较高、草层高，草层密度高且地下茎长而宽，适用于选育营养繁殖率高及固土护坡效果好的品种和种子繁殖型品种。B亚类和第Ⅱ类群花序密度低，但每穗小穗数和千粒重高。第Ⅲ类群大部分性状表现居中。第Ⅳ类群的3个材料Z097，Z164和Z168，草层低矮浓密，叶片光滑，叶色深绿，可作为用于选育坪用质量优异的草坪草亲本。从采样地来看，本研究中聚为一类的材料来源地相差甚远，这与黄春琼[36]和宣继萍[37]利用分子标记研究结缕草属植物的聚类分析结果有很大差别，这可能是因为结缕草属植物的原产地对其表型性状特性可能有着一定的影响，但影响结缕草属植物的表型性状特性的因素有很多，如可能与其对后期种植环境的适应性有一定关系，也可能与育种者的集中管理和广泛栽培加大结缕草属植物种群间的基因交流有关[38]。Liu等[39]通过形态和SRAP分子标记技术同时对来自国内外的42份海雀稗(Paspalumvaginatum)进行遗传多样性分析，发现分子标记的聚类结果显示来源于同一个地区的更容易聚到一起，而形态聚类结果显示聚在一起的材料往往来源地相差甚远，这与本研究对结缕草的研究结果相一致，进一步说明表型形态易受环境影响，因此，下一步工作还应结合分子标记数据对结缕草属植物进行遗传变异综合分析。
3.5 结缕草属优质高产优异种质资源的筛选
本研究筛选了12份具有种子生产潜力的材料，分别是Z039，Z052，Z101，Z107，Z117，Z136，Z145，Z156，Z157，Z158，Z159，Z169。这些材料除了Z117为中华结缕草外，其他均为日本结缕草，表明日本结缕草具有相对较高的生产种子的潜力。聚类分析发现这些材料聚到前两类群中，有2份材料聚类到第I类群的A亚群，7份材料聚类到第Ⅰ类群的B亚群，3份材料聚类于第Ⅱ类群。A亚类的花序密度和每穗小穗数高、千粒重较高，适合筛选具有种子生产潜力的材料。B亚类和第Ⅱ类群的每穗小穗数和千粒重高，花序密度较低，但花序密度所表示的是这一类群的平均情况，聚于这两类中所筛选的具有种子生产潜力的材料所调查的花序密度都比较高。此外本研究还根据营养性状筛选出6份草层低矮浓密，叶色深绿，坪用质量高的材料Z007，Z097，Z143，Z164，Z168和Z0419-8，为进一步培育坪用质量高的新品种提供优异的亲本材料。
本研究从4个方面分析了结缕草属植物表型多样性，发现不同表型性状的变异幅度存在较大的差异，且存在丰富的遗传多样性。基于主成分分析，将22个性状归为5个主成分。通过聚类分析，将144份材料聚为4个类群。根据花序密度、小穗数和千粒重初步筛选出12份具有种子生产潜力的材料，分别是Z039，Z052，Z101，Z107，Z117，Z136，Z145，Z156，Z157，Z158，Z159，Z169。根据坪用性状筛选出6份坪用质量高的材料，分别是Z007，Z097，Z143，Z164，Z168和Z0419-8。这18份材料可作为培育种子繁殖型和坪用型新品种的亲本材料。本研究仅基于表型性状分析结缕草属植物遗传多样性，易受环境因素影响，后续研究应综合分子标记数据，为结缕草属植物新品种选育和资源改良提供更可靠的理论依据。
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