程索婷，孙新宇，王紫彤，任 佩，邹纯才，鄢海燕
皖南医学院药学院，芜湖 241002
胡椒为胡椒科植物胡椒PipernigrumL.的干燥近成熟或成熟果实。秋末至次春果实呈暗绿色时采收，晒干，为黑胡椒。具温中散寒、下气、消痰等功效，用于胃寒呕吐、腹痛泄泻等[1]。胡椒在多种中成药中与其它药味配伍使用，如庆余辟瘟丹[1]、七昧榼藤子丸[1]、帕朱丸[1]、复方蛤青片[1]、活血止痛膏[1]等，也以单独药味使用，如小儿敷脐止泻散[1]。黑胡椒中含有众多的生物碱，具有止痛消炎、抗氧化等多种药理活性[2-5]，胡椒碱是其中代表性成分，也是胡椒的质量标志成分[6]，在《中国药典》2020年版中，胡椒、黑胡椒等药材或以胡椒入药的方剂，多以胡椒碱的含量作为药材或制剂的质量评价指标[1]。现有文献中涉及胡椒的提取方法，也多是单一地以胡椒碱为评价指标，未考虑提取工艺对胡椒中其它生物碱含量的影响[7,8]。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的标示中药内在特性的质量评价方法，自《中国药典》2010年版开始应用于中药的质量控制，主要是HPLC化学指纹图谱[9]，可有效克服单一评价指标的局限性。现有提取工艺的优化，所选用的方法以响应面优化和正交试验居多[10-12]，但响应面优化试验往往存在局限性，所选取的方案并不一定是最佳方案。BP神经网络模拟人脑神经网络功能及其思维方式，以反向传播方式，为达到理想结果而调整网络的权值和阈值来处理复杂的非线性问题[13,14]。为此，本研究拟采用BP神经网络结合中药指纹图谱[14]，通过Box-Benhnken响应面法多指标优化乙醇浓度、料液比和超声时间等因素对黑胡椒提取工艺的影响，明确黑胡椒提取工艺参数，为后续的相关剂型生产提供参考。
1.1 仪器
岛津UV-20A高效液相色谱仪(岛津公司)；
Heidol-LR4010/4011旋转蒸发仪(德国海道尔夫公司)；
FA2004B电子天平(上海越平科学仪器有限公司)；
KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；
RHP-400A型高速多功能粉碎机(浙江永康市荣浩工贸有限公司)。
1.2 材料
黑胡椒(产地：海南，海南觉森电子商务有限公司，批号：20210905)；
胡椒碱(成都埃法生物科技有限公司，纯度≥98%，批号：AF20081753)；
无水乙醇(安徽安特食品股份有限公司，批号：2111073604)；
甲酸(天津市化学试剂三厂，批号：20080828)；
甲醇、乙腈为色谱纯；
无水乙醇、甲酸为分析纯；
水为去离子水。
2.1 溶液的制备
2.1.1 黑胡椒供试品溶液
参照《中国药典》2020版一部胡椒质量标准的含量测定方法[1]，取黑胡椒，粉碎，过50目筛。取粉末约0.1 g，精密称定，置50 mL棕色量瓶中，加入无水乙醇40 mL，避光超声处理30 min，放冷，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，置25 mL的棕色量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.1.2 胡椒碱对照品溶液
取胡椒碱对照品适量，精密称定，置于棕色量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，制得浓度为20 μg/mL的胡椒碱对照品溶液。
2.2 色谱条件
色谱柱YMC-Pack ODS-A C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液(40∶60)，等度洗脱，分析时间100 min，柱温30 ℃；
进样量为10 μL，体积流量1mL/min；
检测波长240 nm，滤膜孔径为0.45 μm。
2.3 黑胡椒HPLC图的建立
按“2.1.1”和“2.1.2”项下方法制备黑胡椒供试品溶液以及胡椒碱对照品溶液，根据“2.2”项下色谱条件进样，记录色谱图。基于保留时间的一致性，根据胡椒碱对照品主峰的保留时间确认黑胡椒提取物HPLC色谱图中S峰为胡椒碱标志物峰(见图1)。
2.4 方法学验证
2.4.1 精密度试验
取同一批黑胡椒粉末，精密称定，按照“2.1.1”项下方法制备黑胡椒供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样5次，记录色谱图。计算胡椒碱的保留时间RSD值为0.20%，峰面积RSD值为0.20%，结果表明方法精密度良好。
2.4.2 重复性试验
取同一批黑胡椒粉末，精密称定，按照“2.1.1”项下方法制备5份黑胡椒供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样，记录色谱图。计算胡椒碱的保留时间RSD值为0.06%，峰面积RSD值为2.45%，说明该方法的重复性良好。
2.4.3 稳定性试验
取同一批黑胡椒粉末，精密称定，按照“2.1.1”项下方法制备黑胡椒供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件，分别于0、4、8、12、16 h进样，记录色谱图。计算胡椒碱的保留时间RSD值为0.08%，峰面积RSD值为0.07%，表明供试品溶液在16 h内稳定性良好。
图1 黑胡椒供试品溶液(A)与胡椒碱对照品溶液(B)的HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms of black pepper test solution (A) and piperine reference solution (B)
2.5 Box-Behnken响应面优化试验
指纹图谱的建立按“2.2”项下色谱条件进样，记录各提取条件下的色谱图，导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.130723版本)中，建立指纹图谱。设置参照图谱S1后，经多点校正，Mark峰匹配并确认共有峰(见图2A～5A)。
2.5.1 单因素试验
考察因素水平设计参考《中国药典》2020年版一部黑胡椒供试品溶液的制备方法[1]和文献[16,17]，根据预试验结果，设置单因素试验主要考察内容为：乙醇浓度、料液比和超声时间。考察因素及其水平见表1。
表1 单因素试验条件
2.5.1.1 乙醇浓度的考察
按照“2.1.1”项下黑胡椒提取物的制备方法，参照“2.5.1”项下考察因素及其水平表，选择料液比为1∶30(g/mL)，超声时间为60 min，分别考察乙醇浓度为100%、95%、90%、85%、80%对黑胡椒提取物HPLC指纹图谱总峰面积标准化值、胡椒碱峰面积归一化值、指纹图谱相似度及综合评价指标的影响，结果见表2和图2。
表2 乙醇浓度对综合评价的影响
图2 乙醇浓度对黑胡椒提取物HPLC指纹图谱(A)及综合评价指标(B)的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on HPLC fingerprint (A) and comprehensive evaluation index (B) of black pepper extract
由图2、表2可知，指纹图谱的相似度为1，乙醇浓度为85%时综合评价指标最低，随着乙醇浓度的升高，综合评价指标升高，并趋于平缓。当乙醇浓度为95%时综合评价指标达到最高值。为此，确定单因素考察的最佳乙醇浓度为95%。
2.5.1.2 料液比的考察
按照“2.1.1”项下黑胡椒提取物的制备方法，参照“2.5.1”项下考察因素及其水平表，结合“2.5.1.1”项下的考察结果，选定乙醇浓度为95%，选择超声时间为60 min，分别考察料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50对黑胡椒提取物HPLC指纹图谱总峰面积标准化值、胡椒碱峰面积归一化值、指纹图谱相似度及综合评价指标的影响，结果见表3和图3。
由表3和图3可知，指纹图谱的相似度为1，随着料液比的比值增加，综合评价指标逐渐增高，并在1∶20(g/mL)时达到拐点，后续随着料液比的增加，综合评价指标基本趋于平稳。结合胡椒碱峰面积归一化值在料液比为1∶20(g/mL)时为峰值即0.778，且在实际生产中料液比过大会增加浪费和污染，综合考虑各方面影响后选取料液比1∶20(g/mL)为单因素考察的最佳料液比。
2.5.1.3 超声时间的考察
按照“2.1.1”项下黑胡椒提取物的制备方法，参照“2.5.1”项下考察因素及其水平表，选定乙醇浓度为95%，料液比为1∶20，分别考察超声时间为40、50、60、70、80 min对黑胡椒提取物HPLC指纹图谱总峰面积标准化值、胡椒碱峰面积归一化值、指纹图谱相似度及综合评价指标的影响，结果见表4和图4。
表3 料液比对综合评价指标的影响
图3 料液比对黑胡椒提取物HPLC指纹图谱(A)及综合评价指标(B)的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on HPLC fingerprint (A) and comprehensive evaluation index (B) of black pepper extract
表4 超声时间对综合评价指标的影响
图4 超声时间对黑胡椒提取物HPLC指纹图谱(A)及综合评价指标(B)的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on HPLC fingerprint (A) and comprehensive evaluation index (B) of black pepper extract
由表4和图4可知，指纹图谱的相似度均大于0.998，超声时间在50 min时综合评价指标达到最大值，并且随着超声时间的增加，综合评价指标逐渐降低。因此，选取50 min为单因素考察的最佳超声提取时间。
2.5.2 Box-Benhnken响应面优化试验
根据Box-Benhnken试验设计原理，在单因素试验的基础上，选取乙醇浓度(A)、料液比(B)和超声时间(C)3个影响因素，利用Design-Expert 8.0软件设计三因素三水平试验表(见表5)，并以综合评价(R)作为评价指标进行黑胡椒提取工艺的Box-Benhnken响应面优化试验。17组试验结果的指纹图谱见图5，Box-Benhnken响应面优化试验结果见表6。
利用Design-Expert 8.0对表6中的各因素与综合评价指标结果进行多元二次回归拟合分析，得到模型回归方程为：R=0.87+1.970×10-3A+0.018B-0.016C-6.241×10-3AB+0.015AC+2.277×10-3BC+0.018×A2-0.013×B2+0.026×C2。黑胡椒提取工艺响应曲面二次回归方程模型方差分析结果见表7。
由表7可知，模型P<0.05，说明该回归模型是可信的；
失拟项P=0.6840>0.05，无显著性差异，说明该模型与实验数据拟合程度较高，存在的误差小。表7中，因素B(料液比)、C(超声时间)的P值<0.05，说明因素B(料液比)、C(超声时间)对综合评价指标有显著影响；
交叉项中A2、C2的P值<0.05，说明A2、C2交叉项对综合评价指标有显著影响。模型的残差正态概率分析结果见图6。
表5 Box-Benhnken响应面试验因素与水平表设计
图5 17组黑胡椒提取物HPLC指纹图谱Fig.5 HPLC fingerprint of 17 groups of black pepper extracts
表6 Box-Benhnken响应面试验设计及结果
表7 回归模型方差分析
续表7(Continued Tab.7)
图6 残差的正态概率分布图Fig.6 Normal probability distribution of residuals
由图6可知，模型的残差正态概率基本分布在同一直线上，说明黑胡椒提取工艺综合评价的实际测得值与模型预测值相差较小。由Design-Expert 8.0软件绘制所得三维表面图见图7。
图7 各因素交互作用对黑胡椒提取工艺的影响Fig.7 Effect of interaction of various factors on extraction of black pepper
由图7可直观地观察响应面的形状和陡峭程度，分析各因素之间相互作用对综合评价指标影响的大小[18]。采取Box-Benhnken响应面法得到的黑胡椒最优提取工艺为：乙醇浓度为90%，料液比为1∶40(g/mL)，超声时间为40 min。
2.6 BP神经网络
现今BP神经网络运用广泛，覆盖了农业、环境、建筑以及软件设计等等，其更可以运用在药物提取工艺的优化上。中药的提取工艺受各种因素的影响，各因素与评价指标之间往往不存在线性关系。BP神经网络方法可以在一个多维空间寻找优化工艺参数的范围[19]，这为提取工艺的优化提供新的设计思路。
2.6.1 模型建立
BP神经网络是一种层状的网络，分为输入层、隐藏层和输出层。输入层信号依次传过各隐藏层，然后传到输出层，每一层的输出只影响下一层的输出[20]。实验采用的为3层结构的BP神经网络建立模型。输入节点数为3，即乙醇浓度(A)、料液比(B)、超声时间(C)；
输出的节点数为1个，即综合评价指标(R)。
2.6.2 网络训练及结果
采用“2.6.1”的模型，使用Matlab 2014a软件进行语言编程，成功构建了1个3-6-1的神经网络模型并进行训练，以“2.5.2”响应面试验中的三组数据(编号为4、5和11)进行赋值训练，并以“2.5.2”响应面试验中的三组数据(编号为1、6和13)进行验证。验证所用的三个因素以及得到的综合评价指标见表8。
表8 BP神经网络学习后验证值
由表8可知，构建的3-6-1的神经网络模型可较好地拟合各因素水平与综合评价指标的映射关系。BP神经网络的训练过程见图8。BP神经网络预测综合评价指标见表6。
图8 BP神经网络训练过程Fig.8 BP neural network training process
BP神经网络预测综合评价指标与Box-Benhnken响应面试验的综合评价指标相近，网络训练的均方误差曲线见图9，误差结果见图10。图9结果显示预测值与实测值非常相近，相关系数R=1，表明该网络模型较好。图10显示，BP神经网络所预测的结果与实际值的误差均小于0.1，可显示该软件所得结果的准确性较好。
图9 均方误差图Fig.9 Mean square error diagram
图10 预测值与实测值的误差图Fig.10 Error between predicted value and measured value
2.6.3 BP神经网络预测结果
将BP神经网络得到的17组预测综合评价指标(见表6)输入Design-Expert 8.0软件，得到的最佳提取工艺为：乙醇浓度100%、料液比 1∶30(g/mL)、超声时间40 min。
2.7 验证试验
取同一批黑胡椒样品，分别按Box-Benhnken响应面优化法和BP神经网络预测的最佳提取工艺进行提取，并计算综合评价指标，结果见表9。
表9 验证试验结果
由表9可知，Box-Benhnken响应面的综合评价指标均值为0.885，RSD值为1.61%；
BP神经网络的综合评价指标均值为0.895，RSD值为0.30%。BP神经网络得到的提取工艺要优于响应面优化所得到的提取工艺且更稳定。为此，最终确定黑胡椒的最佳提取工艺为：乙醇浓度100%，料液比1∶30(g/mL)，超声时间40 min。
中药以多成分相互协调发挥药理作用，但现有文献对胡椒中胡椒碱的提取工艺考察多以单指标即胡椒碱来评价，提取工艺的结果难以反映中药复杂多成分的内在本质。本研究采用多指标(胡椒碱的含量即胡椒碱峰面积占总峰面积之比、黑胡椒共有成分含量即黑胡椒提取物共有峰峰面积占总峰面积之比、指纹图谱相似度)评价黑胡椒中胡椒碱的提取工艺更能反映中药多成分相互协同发挥药效的内在本质，既考虑黑胡椒的主要质量标志物胡椒碱，也考虑了其它未知成分，侧重个体兼顾整体，更科学、可靠，可为胡椒中胡椒碱的提取提供更科学的理论和技术支持。
《中国药典》2020年版和有关文献[21,22]采用HPLC法对胡椒碱进行定量分析，是以甲醇-水为流动相，检测器为紫外检测器，检测波长为343 nm。经过对胡椒碱进行全波长的扫描，发现胡椒碱在240 nm波长处也有吸收峰且吸光度值可满足分析要求，同时在240 nm波长也可满足其它生物碱的测定要求，故本研究中指纹图谱的测定波长选择为240 nm。流动相由甲醇-水改为乙腈-0.1%甲酸水溶液后，各成分间的分离效果也得到明显改善。
以乙醇为提取溶剂对胡椒的提取工艺进行优化已有文献报道。其中Wang等[23]采用正交试验设计，利用超声波提取法获得的黑胡椒中胡椒碱的最佳提取工艺为乙醇浓度80%、料液比1∶20、超声功率700 W、超声时间80 min。Wang等[10]采用响应曲面法设计，利用回流提取法获得的白胡椒中胡椒碱的最佳提取工艺参数为料液比1∶12、提取3次、每次2.0 h。此外，胡椒中胡椒碱的提取还有采用超临界CO2法[24]、酶辅助超临界CO2法[25]、酶法提取[26]等。本研究考虑到实际操作选用了无水乙醇作为提取溶剂，超声波提取法为提取方法来进行进一步的研究。虽然提取工艺的优化以响应面法和正交试验法为多，但响应面法和正交试验法优化试验往往存在局限性，所选取的方案并不一定是最佳方案。BP神经网络可利用神经网络自主学习的能力，弥补以往优化试验中的不足，为提取方法的优化提供新方案[27,28]。本研究基于中药指纹图谱技术，采用Box-Benhnken响应面法结合BP神经网络优化黑胡椒的提取工艺结果表明，BP神经网络得到的提取工艺要优于响应面优化所得到的提取工艺且更稳定。
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