孟凡艳，吴桐忠，王 旭，张星星，韩猛立，钟发刚，胡建军，黄 新
（1.塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300；
2.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所/省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室）
我国奶牛乳房炎的发病率较高，平均每年损失超过3亿元[1]。奶牛乳房炎的发病原因主要是由病原微生物感染引起的[2]。目前已经确定引起奶牛乳房炎的病原微生物约有150种，其中最常见的有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及链球菌等[3]。新疆处于国际公认最适宜奶牛饲养的地区，奶牛养殖业是新疆地区的重要产业[4]。2021年7月份，石河子地区某奶牛养殖场出现了奶牛乳房炎的病例，奶牛乳房红肿，产奶量下降，乳汁呈水样、絮状，对养殖场造成了一定的经济损失。本试验对该养殖场送检的15份乳样进行病原菌分离，通过形态观察、PCR检测及同源性比对确定病原菌，通过药敏试验分析病原菌的耐药性，以期对石河子地区奶牛乳房炎的防控提供科学依据。
1.1 试验材料
1.1.1 病料信息
石河子地区某奶牛养殖场送检乳样15份，标记为样品1 -15号。患病奶牛年龄在2～ 7岁不等，大部分处于产奶后期，乳汁多呈水样，采用紫花地丁、蒲公英、头孢喹啉等药物进行不同程度的治疗，治疗时间为3～24 d不等，治疗效果不佳。详见表1。
表1 送检样品信息
1.1.2 主要试剂
TSA、MH、甘露醇高盐琼脂、麦康凯培养基、细菌微量生化反应管，购自青岛海博生物技术有限公司；
引物、2×master PCR Mix，购自北京全式金生物技术有限公司；
DL2000 Maker，购自Ta KaRa公司；
细菌DNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司；
药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司。
1.1.3 主要仪器
PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪，均为Bio-Rad公司生产。
1.2 试验方法
1.2.1 细菌分离
在无菌条件下，用移液器吸取200 μL乳样接种于LB液体培养基，37 ℃恒温培养箱中过夜培养，再将LB液体培养基中的菌液分别划线接种于麦康凯琼脂、甘露醇高盐琼脂平板上，放于恒温培养箱中过夜培养，观察菌落形态，选择单个菌落进行纯化。在纯化后的细菌中挑取形态良好的单菌落进行革兰氏染色和镜检，观察其形态。
1.2.2 生化试验
无菌挑取纯化后的单菌落或吸取2～ 10 μL单菌落的增菌液，将其注入鉴定生化管内（按照说明书操作），37 ℃恒温培养12 h，部分生化试验需要培养24～48 h后观察结果，结果参照《常见细菌系统鉴定手册》[5]进行判定。
1.2.3 细菌的16S rRNA的鉴定
使用细菌DNA提取试剂盒对分离株的菌液进行细菌DNA的提取（按试剂盒说明书操作），获取细菌DNA后，参照细菌通用引物序列进行PCR扩增，细菌16S rRNA通用引物27F（5′ -AGAGTTTGATCCT⁃GGCTC -3′；
1492R：5′ -CGGCTACCTTGTTAC⁃GACTT -3′，由通用生物系统（安徽）有限公司合成）；
预计扩增片段长度为1 500 bp。PCR扩增采用20 μL体系：dd H2O（8 μL），2×PCR Mix（10μL），上、下游引物（各0.5 μL），DNA模板（1 μL）。扩增程序：95 ℃预变性5 min；
94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，35个循环；
72 ℃延伸10 min。将PCR产物吸取5 μL进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像后，将阳性产物送至通用生物系统（安徽）有限公司进行测序，测序结果与NCBI GenBank数据库中的登录基因序列进行同源性比较与分析。
1.2.4 药物敏感性试验
选取青霉素、阿莫西林、头孢喹啉、头孢他啶、头孢拉定、头孢哌酮、链霉素、庆大霉素、多西环素、麦迪霉素、氟苯尼考、丁胺卡那、多粘菌素B、恩诺沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明、阿奇霉素、替考拉宁、克林霉素等药物采用K -B 法对分离菌进行药敏试验。取100 μL菌液均匀涂布在MH 琼脂平板上，待其干燥后贴上药敏纸片，放置于恒温培养箱中37 ℃过夜培养后将其拿出测量抑菌圈直径，根据CLSI的判定标准对试验结果进行判断。
2.1 细菌分离
接种6、7、13号乳样的营养琼脂培养基在培养24 h后长出黄色且表面光滑的菌落，呈葡萄状排列；
镜检结果显示，为革兰氏阴性菌。接种14号乳样的麦康凯培养基，恒温培养18 h后，菌株形成典型的大肠杆菌样形态特征：圆形，表面光滑且湿润的大菌落；
将细菌进行革兰氏染色后镜检，为革兰氏阴性的短杆菌。共从15份乳样中分离到1株大肠杆菌、5株金黄色葡萄球菌，分离率为40.0%。
2.2 生化试验结果
结合培养特性初步鉴定出1株大肠杆菌和5株金黄色葡萄球菌，为进一步验证结果，进行生化试验。大肠杆菌生化结果显示：分离株可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇；
M.R.显示阳性；
对明胶、V-P试验均为阴性。金黄色葡萄球菌生化结果显示：分离株可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇；
明胶、V-P试验M.R.显示阳性。
2.3 16S rRNA鉴定结果
采用细菌通用16S rRNA 基因引物进行扩增，电泳结果如图1所示。通过测序结果与NCBI 数据库中进行BLAST对比，大肠杆菌同源性大于99.9%，金黄色葡萄球菌的同源性在97.49%～ 99.71%之间，进一步确定了菌株信息。
图1 部分样本16SrRNA PCR鉴定结果
2.4 药敏试验结果
选取从乳样7中分离到的1株金黄色葡萄球菌与从乳样14中分离到的大肠杆菌为代表进行药敏试验，结果见表2。药敏试验结果显示，金黄色葡萄球菌对阿莫西林、头孢喹啉、头孢拉定、头孢哌酮、链霉素、庆大霉素、多西环素、麦迪霉素、氟苯尼考、丁胺卡那、多粘菌素B、恩诺沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明、阿奇霉素和克林霉素17种药物敏感，对替考拉宁耐药、青霉素和头孢他啶的作用尚不清楚；
大肠杆菌对头孢哌酮、庆大霉素、氟苯尼考、丁胺卡那、恩诺沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明和阿奇霉素9种药物敏感，对青霉素、阿莫西林、头孢拉定、链霉素、麦迪霉素、替考拉宁和克林霉素的作用尚不清楚，对剩余的4种药物表现为中介。
表2 药敏试验结果
经过对乳样进行分离鉴定，本试验共分离出6株菌株，通过形态学观察、生化试验、测序比对等，最终确定为1株大肠杆菌和5株金黄色葡萄球菌。
引起奶牛乳房炎的细菌主要是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和链球菌，三者总比例可占到90%以上，同时金黄色葡萄球菌的带菌率最高，本次实验中分离到的菌株主要为金黄色葡萄球菌，与双金[6]等研究相符。
临床中常常使用抗菌药物对奶牛乳房炎进行治疗，但由于近年来抗菌药物的滥用导致临床中产生严重的耐药性，致使奶牛乳房炎治疗效果较差，同时抗生素在畜产品中的残留问题，也严重危害着消费者的健康。本试验中，金黄色葡萄球菌对阿莫西林、头孢喹啉、头孢拉定等17种药物敏感，大肠杆菌对头孢哌酮、庆大霉素、氟苯尼考等9种药物敏感。今后在该养殖场的用药中，我们要选择敏感的药物进行治疗，如庆大霉素、环丙沙星、恩诺沙星等，而且要交替使用，避免耐药性的产生。
我国是畜牧业养殖大国，奶牛养殖在我国畜牧业生产中占有较大比例，其中在奶牛养殖业中，牛奶的产量是决定生产效益的较大因素之一，但奶牛感染乳腺炎后导致泌乳下降，造成治疗成本升高和死亡率增加，给我国奶牛业带来严重的经济损失[7]。因此，在实际生产中，我们要及时查明奶牛乳房炎的病因，对病原进行有效控制，及时减少不必要的经济损失。
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