唐军伟 彭洪 郑和平 黄梅 龚磊 马一丹 张燕
(南充市中心医院 1.中西医结合科；
2.肛肠外科；
3.胃肠外科，四川 南充 637000)
结直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，其早期症状并不明显[1-2]。在全球范围内结直肠癌发病率仅次于肺癌和胃癌位居第三。结直肠癌从癌前病变(腺瘤)发展到恶性病灶有一个较长的过程，但是其具体发病机制尚不清楚，因此阐明结直肠癌的具体发病机制是一个亟待解决的问题[3-5]。肌球蛋白主要存在于平滑肌中，是肌原纤维粗肌丝的主要组成成分，其分子形态如豆芽状，由多条重链和多条轻链构成[6]。肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(Myosin phosphatase-targeting subunit 1，MYPT1)属于哺乳动物MYPT家族，其功能是调控亚细胞定位和底物特异性[7-8]。MYPT家族成员有多个共同的保守结构域，包括与催化亚基PP1c结合的RVXF基序和多个锚蛋白重复序列，参与人体多种生理活动，并与肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移密切相关[9-11]。最近的研究发现MYPT1可能作为miR-30d的直接作用靶点促进前列腺癌的血管生成和肿瘤生长。体内实验也表明MYPT1可下调VEGF和CD31的表达，并可抑制小鼠微血管内皮细胞增殖和肿瘤血管的形成[12]。但是MYPT1在结直肠癌组织中的表达及其与结直肠癌发生发展的关系鲜有报道。本研究检测MYPT1在结直肠癌组织中的表达并分析其与结直肠癌恶性生物学行为的关系，探讨MYPT1是否通过RhoA/ROCK信号通路调控细胞增殖和迁移，以期为结直肠癌的诊断和治疗提供新的肿瘤标志物及药物治疗靶点。
1.1 主要材料与试剂 人结直肠癌细胞株HCT116、SW480、LOVO与正常人结肠上皮细胞株HCoEpiC购自中国科学院细胞库(上海，中国)。细胞计数试剂盒8(CCK8)购自Beyotime公司(上海，中国)。酶标仪购自Bio-Rad公司(Hercules,CA,USA)。10%胎牛血清、TRIzol试剂购自Invitrogen公司(Carlsbad, CA,USA)。RIPA缓冲液购自Thermo Fisher 公司(Waltham, MA, USA)。Cat lgG二抗购自Sungene Biotech公司(上海，中国)。RHOA和ROCK1一抗购自Abcam公司(Cambridge, MA, USA)。Transwell小室购自Corning公司( Costar, CA, USA)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养和转染 细胞在含有10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中生长，培养箱中含有5%的CO2，培养温度为37℃。按照说明书，用慢病毒表达载体在细胞中转染LV-MYPT1(MYPT1过表达组)、LV-MYPT1 NC(MYPT1阴性对照组)、LV-RhoA(RhoA过表达组)和LV-RhoANC(RhoA阴性对照组)。根据实验方案不同进行不同分组。检测MYPT1对细胞增殖和迁移的影响时分为空白对照组、阴性对照组(LV-MYPT1 NC)及MYPT1过表达组(LV-MYPT1)；
检测MYPT1对RhoA和ROCK1蛋白表达的影响时分为空白对照组和MYPT1过表达组；
检测RhoA对细胞增殖和迁移的影响时分为空白对照组、阴性对照组(LV-RhoA NC)及RhoA过表达组(LV-RhoA)组；
检测MYPT1通过负调控RhoA抑制ROCK1基因表达和结直肠癌细胞增殖和迁移时分为阴性对照组(LV-MYPT1 NC)、MYPT1过表达组(LV-MYPT1)、MYPT1过表达+RhoA空载组(LV-MYPT1+LV-RhoANC)和MYPT1过表达+RhoA过表达组(LV-MYPT1+LV-RhoA)。
1.2.2 CCK8检测 采用CCK8法检测细胞增殖活性。将对数生长期的细胞收集，消化后计数，制成密度为5×104cells/mL的细胞悬液，在96孔板上每孔加入100 μL细胞悬液。培养24、48、72 h后，每孔添加10 μL CCK8溶液，继续培养4 h后用酶标仪测量450 nm波长处OD值。
1.2.3 qRT-PCR检测 根据说明书使用TRIzol试剂从结直肠癌细胞中提取总RNA,再用MiScript SYBR Green PCR试剂盒进行逆转录，使用ABI7500快速实时PCR系统检测mRNA的相对表达水平，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。引物序列如下：MYPT1：5′-GAGCCTCCGGTGGTGAAG-3′(forward)，5′-GGCAGTGAGTCCGTCCAC-3′(reverse)；
ROCK1：5′-AACATGCTGCTGGATAAATCTGG-3′(forward)，R: 5′-TGTATCACATCGTACCATGCC T-3′(reverse)。
1.2.4 Western blot检测 采用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀分析(RIPA)缓冲液进行蛋白质提取,根据说明书采用BCA法测量蛋白质浓度。用10% SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后转移到PVDF膜上，室温下用脱脂牛奶或BSA溶液(5%)封闭PVDF膜1 h,然后将膜与一抗在4℃下孵育过夜。第二天用TBST溶液(10 min/次)冲洗PVDF膜3次，然后在室温下用二抗孵育1 h。使用增强化学发光底物试剂盒和ImageJ软件(NIH, Bethesda, Maryland, USA)检测蛋白表达。用Quantity One V4.6.2软件(Bio-Rad，USA)分析蛋白灰度值。
1.2.5 Transwell 使用Transwell小室进行细胞迁移能力分析。Transwell小室含有明胶涂层聚碳酸酯膜过滤器(孔径为8 μm)，将细胞以每孔40000个细胞的密度接种，24 h后用D-PBS冲洗，按照说明书进行细胞迁移能力的评估，考马斯蓝染色后在显微镜下观察细胞并计数。
1.3 生物学数据库的使用 使用蛋白质互作数据库(https://string-db.org/)分析可与MYPT1相互作用的蛋白质，并使用GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)数据库分析基因在结直肠肿瘤组织中的表达及不同基因表达的相关性。
2.1 MYPT1在结直肠癌患者中低表达 首先通过GEPIA数据库分析结直肠癌组织和癌旁正常组织中MYPT1的表达水平，结果显示在结肠癌和直肠癌组织中MYPT1均呈低表达(P<0.05)，见图1。
图1 MYPT1在结直肠癌中的表达
2.2 MYPT1在结直肠癌细胞中低表达 通过qRT-PCR法检测结直肠癌细胞株HCT116、SW480、LOVO与正常人结肠上皮细胞株HCoEpiC中MYPT1表达水平。结果显示，与HCoEpiC细胞株(0.96±0.04)相比，MYPT1在结直肠癌细胞株HCT116(0.38±0.04，t=21.437，P<0.01)、SW480(0.42±0.05，t=19.31，P<0.01)、LOVO(0.58±0.05，t=13.14,P<0.01)中的表达水平均明显降低，见图2。选择SW480进行后续实验。
图2 MYPT1在结直肠癌细胞株中的表达
2.3 过表达MYPT1抑制结直肠癌细胞增殖 为分析MYPT1对细胞增殖的影响，本研究构建了MYPT1过表达载体LV-MYPT1及空白载体LV-MYPT1 NC，CCK8检测结果显示，24 h时，各组间细胞增殖活性无明显差异(P>0.05)；
48、72 h时，与空白对照组及阴性对照组相比，MYPT1过表达组细胞增殖能力明显降低(P<0.05)，见表1。
表1 MYPT1对细胞增殖的影响
2.4 过表达MYPT1抑制结直肠癌细胞迁移 Transwell结果显示，与空白对照组(53.67±3.51,t=10.898,P=0.01)及阴性对照组(55.33±2.52,t=10.898,P<0.01)相比，MYPT1过表达组(26.00±2.65)细胞迁移能力明显降低，见图3。
图3 MYPT1对结直肠癌细胞迁移能力影响
2.5 通过生物信息学数据库分析MYPT1相互作用蛋白 为探寻MYPT1发挥作用的机制，我们通过蛋白质互作数据库https://string-db.org分析可与MYPT1相互作用的蛋白，发现RhoA可与MYPT1基因编码的蛋白磷酸酶1调节亚单位12A (Protein Phosphatase 1 Regulatory Subunit 12A，PPP1R12A)相互作用，见图4。
图4 筛选可与PPP1R12A相互作用的蛋白
2.6 MYPT1负调控RhoA和ROCK1蛋白表达 为分析MYPT1对RhoA及其下游信号通路关键蛋白ROCK1表达的影响，通过Western blot检测过表达MYPT1后RhoA和ROCK1蛋白表达水平，结果显示与空白对照组相比，MYPT1过表达组中RhoA(t=29.942,P<0.01)和ROCK1(t=50.278，P<0.01)蛋白表达水平均明显降低，见图5。
图5 MYPT1对RhoA和ROCK1蛋白表达的影响
2.7 RhoA和ROCK1表达呈正相关 通过GEPIA数据库分析结直肠癌中RhoA和ROCK1表达的相关性，结果发现RhoA和ROCK1表达呈正相关，见图6。
图6 RhoA和ROCK1表达的相关性
2.8 过表达RhoA促进结直肠癌细胞增殖 进一步分析RhoA对结直肠癌SW480细胞增殖能力的影响，结果显示，24 h时，各组细胞增殖活性无明显差异(P>0.05)；
48、74 h时，与空白对照组及阴性对照组相比，RhoA过表达组中SW480细胞增殖能力明显增强(P<0.05)，见表2。
表2 过表达RhoA对细胞增殖的影响
2.9 过表达RhoA促进结直肠癌细胞迁移 本研究分析了RhoA对结直肠癌SW480细胞迁移能力的影响，结果显示与空白对照组(32.67±3.06，t=-6.682,P=0.003)及阴性对照组(34.33±4.04，t=-5.128,P=0.007)相比，RhoA过表达组(49.33±3.06)中SW480细胞迁移能力明显增强，见图7。
图7 RhoA对结直肠癌细胞迁移能力的影响
2.10 MYPT1通过负调控RhoA抑制ROCK1基因表达 本研究接下来分析了MYPT1是否通过抑制RhoA的表达从而负调控ROCK1的表达。使用qRT-PCR法检测ROCK1的表达，结果显示与阴性对照组(0.95±0.06)相比，MYPT1过表达组(0.56±0.05,t=11.99,P<0.01)及MYPT1过表达+RhoA空载组(0.59±0.05,t=10.583,P<0.01)中ROCK1表达水平明显降低；
与MYPT1过表达组(t=-6.624,P<0.01)及MYPT1过表达+RhoA空载组(t=-5.786,P<0.01)相比，MYPT1过表达+RhoA过表达组(0.74±0.03)中ROCK1表达水平则有所增高，证实MYPT1通过负调控RhoA抑制ROCK1基因表达,见图8。
图8 MYPT1通过负调控RhoA抑制ROCK1基因表达
2.11 MYPT1通过负调控RhoA抑制结直肠癌细胞增殖 为验证MYPT1通过负调控RhoA抑制结直肠癌细胞增殖，使用CCK8法检测细胞增殖能力，结果显示，24 h时，各组细胞增殖能力无明显差异(P>0.05)，48、72 h时，与阴性对照组相比，MYPT1过表达组及MYPT1过表达+RhoA空载组中细胞增殖能力明显降低，但是与MYPT1过表达组及MYPT1过表达+RhoA空载组相比，MYPT1过表达+RhoA过表达组中细胞增殖能力则有所增高(均P<0.05)，证实RhoA可逆转MYPT1对细胞增殖活性的抑制作用，见表3。
表3 MYPT1通过负调控RhoA抑制结直肠癌细胞增殖
2.12 MYPT1通过负调控RhoA抑制结直肠癌细胞迁移 通过拯救实验本研究验证MYPT1是否通过负调控RhoA抑制结直肠癌细胞迁移，通过Transwell法检测细胞迁移能力，结果显示与阴性对照组(93.33±3.06)相比，MYPT1过表达组(59±3.00,t=13.889,P<0.001)及MYPT1过表达+RhoA空载组(61.67±2.52,t=13.857,P<0.001)中细胞迁移能力明显降低；
与MYPT1过表达组(t=-6.054,P=0.004)及MYPT1过表达+RhoA空载组(t=-5.353,P=0.006)相比，MYPT1过表达+RhoA过表达组(72.67±2.52)中细胞迁移能力则有所增高，证实MYPT1对细胞迁移能力的抑制作用至少部分是通过负调控RhoA实现的，见图9。
图9 MYPT1通过负调控RhoA抑制结直肠癌细胞迁移
肿瘤细胞的增殖失控、侵袭和迁移是恶性肿瘤最基本的生物学特征。肿瘤细胞的迁移和侵袭可由多种化学物质诱导，这些化学诱导剂和相关的一些细胞因子可与肿瘤细胞表面的受体结合，激活细胞内的信号转导通路并调节细胞骨架的重组，从而促进肿瘤细胞的增殖和转移[13-14]。研究发现肌球蛋白作为细胞骨架的重要组成部分，可通过对其轻链磷酸化和去磷酸化的调节影响肌球蛋白的活性，在肿瘤的增殖和迁移中发挥着重要作用[15]。还有研究表明由于细胞分裂依赖细胞骨架的活性，并且细胞的运动行为依赖于细胞骨架的动态变化，因此肌球蛋白轻链的磷酸化可通过调控肌球蛋白和肌动蛋白的相互作用影响细胞骨架的活性，进一步增强肿瘤细胞的增殖和迁移能力[16]。MYPT1是蛋白磷酸酶1(Protein phosphatase 1，PP1)的调控亚单位，MYPT1和PP1的复合物可以通过去磷酸化肌球蛋白轻链调控肿瘤细胞增殖和转移。既往研究发现MYPT1在多种恶性肿瘤中低表达，过表达MYPT1可抑制胃癌的发生发展和转移，并且在卵巢癌细胞和动物模型中敲除MYPT1可促进肿瘤的生长及导致对铂类药物耐药性的增加[17-18]。通过GEPIA数据库本研究发现MYPT1在结肠癌和直肠癌组织中的表达水平明显降低，与正常人结肠上皮细胞株HCoEpiC相比，MYPT1在结直肠癌细胞株HCT116、SW480、LOVO中的表达水平也明显降低，并且过表达MYPT1可抑制结直肠癌细胞株的增殖和迁移。结果表明MYPT1在结直肠癌的发生发展中扮演着抑癌基因的角色，与既往研究结果相符，证实MYPT1可作为结直肠癌新的肿瘤标志物及潜在的药物作用靶点。
本研究探讨了MYPT1发挥抑癌作用的分子机制。通过蛋白质互作数据库分析了可与MYPT1编码的PPP1R12A蛋白相互作用的蛋白，发现RhoA可与PPP1R12A相互作用。RhoA是Rho小G蛋白家族的一员，参与调节肌动蛋白细胞骨架重排[19-21]。越来越多的数据表明RhoA信号通路通过肌动蛋白细胞骨架重排参与肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭。RhoA可诱导应力纤维的形成并可将细胞外信号传递给肌动蛋白和微管细胞骨架。ROCK1是ROCK家族之一,也是RhoA蛋白的下游激酶，其可增加肌球蛋白磷酸化，促进细胞产生收缩力，而这种张力是细胞增殖所必需的。ROCK1还可以通过磷酸化肌球蛋白轻链增强肌动球蛋白的收缩能力[22]。研究表明RhoA/ROCK信号通路是癌症进展的关键信号通路[23],Wang等[24]的研究发现激活RhoA/ROCK信号通路可以增加卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力,Xia等[25]的研究证实RhoA/ROCK信号通路参与血管生成拟态的形成，抑制RhoA/ROCK信号通路可通过减少肿瘤血供抑制非小细胞肺癌的生长和转移。因此靶向RhoA/ROCK信号通路可能是抑制肿瘤细胞增殖和迁移的有效策略。本研究发现过表达MYPT1可抑制RhoA和ROCK1蛋白的表达，RhoA和ROCK1表达呈正相关，并且过表达RhoA可促进结直肠癌细胞的增殖和迁移，提示MYPT1可能通过RhoA信号通路发挥抑癌作用。进一步通过功能回复实验发现与阴性对照组相比，MYPT1过表达组及MYPT1过表达+RhoA空载组中ROCK1表达水平明显降低，细胞增殖和迁移能力明显降低，但是与MYPT1过表达组及MYPT1过表达+RhoA空载组相比，MYPT1过表达+RhoA过表达组中ROCK1表达水平、细胞增殖和迁移能力有所增高，表明RhoA可逆转MYPT1对ROCK1基因表达的下调作用和对细胞增殖和迁移能力的抑制作用，证实MYPT1通过RhoA/ROCK信号通路抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移。
MYPT1通过调控RhoA/ROCK信号通路抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移，为阻断结直肠癌的发生发展提供了潜在的治疗靶点。但是MYPT1的上游调控基因及其在动物实验中的作用还需要进一步的研究。
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