贺 腊 李毓龙 余松川
四川省简阳市人民医院检验科（四川 简阳 641400）
勃起功能障碍(ED)的特征是在性活动期间无法实现或维持足够的勃起硬度来完成满意性生活[1]，往往伴有高血压、冠状动脉粥样硬化和糖尿病等[2]。估计到2025年全球将有3.22 亿男性患有ED[3]。海绵体内皮参与海绵体平滑肌细胞松弛这一生理现象，有助于勃起功能的启动和维持[4]。H2S（硫化氢）信号已被证实参与勃起生理学反应，并且在动物实验中被证明可松弛海绵体并增强其勃起功能[5]。H2S 由CYS（半胱氨酸）通过胱硫醚γ-裂解酶(CSE)和胱硫醚β-合酶(CBS)的酶活性内源形成，这两种酶已被发现在人阴茎海绵体和血管中功能性表达[6]。最近，有研究证明H2S 及CYS能通过涉及cGMP 积累的机制松弛勃起功能障碍患者的阴茎海绵体和阴茎动脉[7]。阴茎平滑肌松弛通路的改变会阻碍与勃起有关的血流动力学过程并导致ED，ED的常规治疗涉及通过抑制5 型磷酸二酯酶(PDE5) 来增强NO/cGMP 途径，但存在部分患者对这种治疗策略没有反应。笔者就此进行研究，探究勃起功能障碍患者海绵体CYS/H2SmRNA 表达及其影响机制，旨在为此类患者治疗寻找新靶点提供一定依据，现报道如下。
一、材料
样本来源 研究样本来自我院2016年-2021年无勃起功能障碍阴茎延长术患者24例（对照组）及同期接受阴茎假体植入患者24例（研究组），患者及其家属均知情并同意参与研究，本研究经我院医学伦理委员会批准，简医伦审2021029，取患者阴茎组织，保存在4-6°C的灭菌M-400 溶液中（每100 毫升的组成：甘露醇，4.19 克；
KH2PO4，0.205 克；
K2HPO4·3H2O，0.97 克；
KCl，0.112 克；
NaHCO2，0.07.08 克）待测。
主要试剂 免疫荧光染色试剂盒（南京凯根生物科技有限公司）；
酶联免疫吸附试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；
山羊抗小鼠β-actin、Bax、Bcl-2、Caspase-3一抗购自北京百奥莱博科技有限公司等。
主要仪器 DM 750 型光学显微镜（日本Olympus公司）；
Spectra Max M5型多功能酶标仪（美国Molecular Devices 公司）；
RM2235 型石蜡切片机（德国Leica公司）；
定量PCR 仪器（赛默飞世尔科技）；
全自动免疫分析仪（美国雅培制药）等。
二、方法
（一）海绵体组织（human corpus cavernosum，HCC）的功能评价
将海绵体组织条带(3×3×7 mm) 浸入8 mL 含有Krebs-Henseleit 溶液的器官室中，该溶液由以下成分(mM) 组成：NaCl 119、KCl 4.6、CaCl2 1.5、MgCl2 1.2、NaHCO324.9、葡萄糖 11，KH2PO4 1.2，EDTA 0.027；
在37℃下用95%O2/5%CO2混合物连续鼓泡以保持pH值为7.4，用于如前所述的等长张力记录（MartínezSalamanca 等人，2015 年；
La Fuente 等人，2019 年）。1 µM去氧肾上腺素(PE)的最大收缩反应下降每个组织条逐渐拉伸到最佳等长张力。然后将制剂暴露于高K+浓度(125 mM)并测量收缩反应，并通过观察NaHS 或CYS表达来评估松弛反应。
（二）蛋白质印迹分析
从HCC 中提取总蛋白质样品。HCC 组织用预冷的组织裂解液匀浆，4℃12,000 rpm 离心15 分钟，取上清液。使用BCA 蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。将等浓度的蛋白质裂解物加载到10%十二烷基硫酸钠/聚丙烯酰胺凝胶电泳上，电泳80 V 30 分钟和120 V 60 分钟，然后电转移到聚偏二氟乙烯膜。用5%脱脂奶粉室温封闭膜1h。然后，将膜与CaSR、PLC、PKCδ、JNK，p38，Bax，GAPDH 抗体 4℃过夜，然后清洗膜并与适当的辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下孵育1 小时。最后使用增强型化学发光检测系统（Clinx Science Instruments, U.S.A.）观察蛋白质条带。测量β-actin 表达水平作为内源参考并用于标准化。根据 2-ΔΔCt方法计算相对表达。
（三）cGMP含量的测定
使用NaHS(1 mM)或CYS(1 mM)5 分钟后，立即将HCC 条浸入液氮中冷冻并储存在-80°C 直至提取环核苷酸。组织在6 次均质中提取%三氯乙酸，然后用乙醚（H2O 饱和）萃取并冻干。使用ayman Chemical Company 的试剂盒，通过酶联免疫吸附测定法测定cGMP 的浓度，试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。
（四）免疫荧光检测
将 HCC 浸入蔗糖（30% w/v）中，嵌入包埋剂（optimum cutting temperature，OCT）中并储存在-80°C下。OCT 块在低温恒温器中切片。用丙酮处理去除OCT，用含有 2%BSA 的 PBS 封闭 30 分钟，然后与兔抗体抗人CBS（1∶200 稀释）和 CSE（1∶100 稀释）在4°C 下孵育过夜。PBS 洗涤后，将切片与二级Alexa Fluor 488 偶联山羊抗兔抗体孵育45 分钟在室温下和300 nM 二脒基-2-苯基吲哚在室温下复染细胞核5 分钟。切片安装并通过荧光显微镜观察。
（五）CYS、H2S水平检测
取 HCC 组织制成匀浆，3000r/min 离心 20min，取上清液，使用酶联免疫吸附试验检测。试剂盒分别为CYS Elisa检测试剂盒，购自默克生物；
H2S Elisa检测试剂盒购自武汉塞培生物。
三、统计学方法
一、ED患者CYS/H2S 通路受损
研究组患者HCC 组织中CYS、H2S 水平显著低于对照组（P＜0.05）。见图1。
图1 两组CYS、H2S水平比较()
二、ED与人海绵体对CYS/H2S 通路介导的松弛反应降低有关
研究组患者HCC 中NaHS及CYS的 pEC50、Emax显着降低（P＜0.05），NaHS 的Emax无显著变化（P＞0.05）。ED 与CYS、NaHS 诱导的HCC 松弛反应降低显著相关见表1，图2。
表1 两组pEC50、Emax比较（）图中第二条横线中间
表1 两组pEC50、Emax比较（）图中第二条横线中间
组别对照组（n=24）研究组（n=24）CYS NaHS t P pEC50 4.92±0.25 3.83±0.19 17.006 0.000 Emax（%）68.04±5.53 47.18±4.26 14.640 0.000 pEC50 4.84±0.21 4.07±0.16 14.288 0.000 Emax（%）95.25±8.04 87.57±7.55 3.411 0.001
图2 相关性分析曲线
三、ED患者的HCC中CYS及NaHS产生cGMP的能力降低
研究组患者HCC中CYS及NaHS诱导的cGMP表达显著低于对照组（P＜0.05），见图3。
图3 两组产生cGMP能力比较（）
四、ED患者Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白相对表达变化
研究组患者HCC中Bax、Caspase-3蛋白相对表达显著高于对照组，Bcl-2蛋白相对表达显著低于对照组（P＜0.05），见（图4a和图4b)。
图4 两组Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表达
五、ED 患者 HCC 中 H2S 合成酶 CSE 和 CBS 表达降低
免疫荧光检测结果显示，相较对照组，研究组HCC中CSE和CBS表达减少。见图5。
图5 两组免疫荧光检测结果
近年来，ED 发病率呈现逐年上升趋势，严重影响男性身心健康。尽管目前已有包括基因治疗、干细胞移植、5-磷酸二酯酶(PDE5)抑制剂和低能量冲击波治疗ED新途径[8]。然而ED发病机制尚未阐明，仍有部分患者疗效不够理想。最近有研究报道了通过对来自ED患者阴茎组织外源性添加稳定的H2S 类似物(NaHS)或CYS促H2S产生导致HCC)松弛和阴茎动脉(HPRA)的血管舒张[9-10]。进一步证实了CYS/H2S 通路驱动阴茎血管组织松弛的能力。
本研究创新性在于，笔者发现ED 患者病情发生发展与其HCC 和HPRA 中CYS/H2S 信号传导受损具有密切联系。从这个意义上说，ED 中CYS/H2S 途径的主要改变是由内源性H2S 产生介导的功能反应受损。事实上，NaHS 诱导的松弛在HCC 中受到ED 的轻度损害，由CYS 诱导的松弛/血管舒张显然比由外源性添加的H2S 类似物诱导的反应更受ED 的影响。Aydinoglu 等[11-12]发现用氨氧乙酸和炔丙基甘氨酸抑制H2S 合成酶会减弱CYS 在小鼠和人类阴茎组织中的松弛能力，证实CYS 诱导的松弛需要内源性产生H2S。此外，本研究也显示来自ED 患者的HCC中CYS 诱导的松弛显着减少，与其结果基本相符。cGMP 信号在人类和动物阴茎组织以及其他组织中的参与勃起功能调节[13]。人阴茎组织中与ED 相关的CYS/H2S 通路的功能障碍与CYS 诱导ED 患者HCC 中cGMP 积累的能力显着降低一致。分析cGMP 测定表明ED 患者的海绵体组织中H2S 的产生功能失调，而不是该气体递质刺激cGMP 积累的功效降低，因为未检测到NaHS增加这些组织中cGMP 的能力显著降低。H2S 还是一种细胞凋亡调控因子，有研究指出其可通过抑制caspase-3表达提高细胞活性，减少细胞凋亡[14]。但其是否参与海绵体细胞损伤引起ED 尚未得到证实。细胞凋亡是维持细胞环境动态平衡的基本程序性细胞死亡过程。Bcl-2家族由抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax组成。Bcl-2 是著名的具有代表性的凋亡抑制因子，而Bax 可以与Bcl-2 结合形成异源二聚体，拮抗Bcl-2对细胞凋亡的抑制作用，促进细胞凋亡。另一方面，Bax 还激活caspase-3，促进Ca2+释放，进而导致细胞凋亡。Caspase-3 作为代表性的执行者在细胞凋亡中起着举足轻重的作用。因此，Bax、Bcl-2和caspase-3水平被认为是评价细胞凋亡的指标。本研究结果可见，研究组患者HCC 中Bax、Caspase-3 蛋白相对表达显著高于对照组，Bcl-2 蛋白相对表达显著低于对照组（P＜0.05）。提示ED 患者CYS/H2S 通路损伤可能引起ED。
此外，在内皮动脉平滑肌中均检测到CBS 和CSE的表达。然而，Aydinoglu 等[15]指出在小鼠海绵体中，H2S 产生CYS 具内皮依赖性。虽然最初认为H2S 仅由血管平滑肌细胞合成，但后来证明它也可以由内皮细胞产生，并在内皮血管舒张中起重要作用[16]。蛋白质硫化被认为是内源性硫化氢对内皮功能影响的机制，无论精确的分子机制如何，目前的结果都与内皮功能和内源性硫化氢生成的血管舒张能力之间的联系一致，本研究中 ED 与 CYS、NaHS 诱导的 HCC 松弛反应降低显著相关这一结果也对其进行了证实。ED 患者海绵体组织中两种主要H2S 合成酶表达的显着降低可以解释与健康组织相比，这些组织中CYS/H2S 通路的功能受损。免疫荧光检测显示ED患者的HCC中CBS和CSE表达均显着降低，这表明CYS诱导的阴茎血管组织松弛的缺陷可能是由于CBS和CSE的表达受到抑制。这些酶的表达降低会导致暴露于CYS后H2S的可用性降低，cGMP 积累减少，从而导致 ED 患者 HCC 松弛减弱。
本研究不足：尽管根据目前的数据，以上推论及分级是合理的，但应该注意的是，本研究报告的CYS 诱导的松弛受损与CBS 和CSE 下调之间的关系仅具有关联性，缺乏操纵酶表达的因果证据。目前数据的另一个不足是缺乏海绵体组织中H2S 测量，此外，现在人们普遍认为，H2S 的产生会导致心血管疾病的血管功能障碍[17]，从这个意义上说，在高血压动物模型中已经报道了CBS和CSE血管表达降低。此外，导致CBS或CSE表达降低的小鼠基因敲除已被证明会导致内皮依赖性松弛缺陷和血压升高，同时，在患有ED 的糖尿病大鼠的海绵体组织中，观察到CBS 和CSE 表达但活性较低[18-19]，但需要进一步证实其在人体组织中变化趋势及作用机制，为进一步研究提供基础。
综上所述，ED患者的海绵体组织和阴茎动脉显示出受损的CYS/H2S 介导的海绵体平滑肌松弛和cGMP积累，这与这些组织中H2S合成酶、CBS和CSE的表达降低有关，其可能通过影响患者正常海绵体松弛及海绵体细胞凋亡影响患者勃起功能。
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