吴昊宇，尹亚萍，吴艳萍，马 焜，李百祥
（哈尔滨医科大学公共卫生学院毒理学教研室，黑龙江哈尔滨 150081）
均三氮苯类除草剂属于选择性、内吸传导型低毒除草剂，适用于玉米田、甘蔗田、高粱田等农作物[1]。均三氮苯类除草剂作为典型的光合作用抑制剂，可抑制植物的光合作用和呼吸作用，干扰植物激素、氮及核酸代谢，影响土壤微生物的硝化和氨化作用。阿特拉津（atrazine, ATR）、西玛津（simazine, SIM）、氰草津（cyanazine, CYA）是3 种结构相似的均三氮苯类除草剂，因其具有高效、低毒、广谱的特点，在农业生产中被广泛应用[2]。这类除草剂可明显提高农作物的产量，但其半衰期长，不易降解，在土壤、空气、农作物以及地表水或地下水中等均能检出残留，对人、畜及土壤中微生物等均具有潜在的环境毒性作用。研究表明，均三氮苯类除草剂具有免疫毒性，降低大鼠脾脏和胸腺脏器系数；
以及干扰T 淋巴细胞转化能力[3]；
具有生殖和发育毒性，使哺乳动物性腺发育异常，精子活性降低，生殖能力下降[4]；
还具有遗传毒性，长期接触可导致精子和卵巢形态异常，进而影响正常的胚胎发育[5]。最新研究发现，均三氮苯类除草剂可透过血-脑屏障，引起中枢神经系统的损伤，但其具体机制尚未明确。ATR、SIM 和CYA 在结构上存在细微差别（图1），可能导致其生物学效应明显不同。PC-12 细胞作为多巴胺能神经元体外细胞模型，可以合成、释放及分泌神经递质，如多巴胺、去甲肾上腺素及儿茶酚胺等。因此，在基础研究和新的临床治疗中，PC-12 细胞可以间接地替代多巴胺能神经元[6]。本研究通过体外细胞实验，初步探讨和比较ATR、SIM 和CYA致多巴胺能神经元PC-12 细胞凋亡的作用机制，以阐明均三氮苯类除草剂与多巴胺能神经系统毒性的关系，为后续研究均三氮苯类除草剂的神经毒性提供有效的毒理学依据。
图1 阿特拉津、西玛津和氰草津的结构式Fig.1 Structural formula of atrazine, simazine and cyanazine
1.1 主要试剂与仪器
ATR、SIM、CYA（山东滨农科技有限公司）；
大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤PC-12 细胞（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）；
CCK-8 试剂盒（日本同仁有限公司）；
ROS 测定试剂盒（上海碧云天生物有限公司）；
一抗兔抗多克隆抗体Bcl-2、Bax、p53、Caspase-3（美国Immunoway 生物科技有限公司）；
二抗碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；
PrimeScriptRT 试剂盒，SYBR Premix ExTaqII 试剂盒（日本TaKaRa 生物公司）；
ABI-7500 实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）；
SDSPAGE 电泳设备及转膜仪（美国Bio-Rad 公司）。
1.2 细胞培养及处理
PC-12 细胞用RPMI-1640 完全培养基（含有100 mL/L 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL链霉素），在50 mL/L CO2的37 ℃培养箱中孵育。对数生长期PC-12 细胞按照1×104/mL 接种并进行分组，实验分为ATR 组、SIM 组和CYA 组、对照组，前3 组分别以200 μmol/L 的ATR、SIM 和CYA 处理细胞24 h，而对照组仅添加相同溶剂。每组设6 个孔。
1.3 CCK-8 试剂盒检测细胞存活率
将PC-12 细胞接种于96 孔板，边缘孔用无菌PBS 填充，培养箱内孵育至细胞单层铺满孔底时，按1.2 项 分 组 干 预，分 别 以200 μmol/L ATR、SIM 和CYA 处理细胞24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，继续培养2 h。用酶标仪于450 nm 处测量各孔的吸光度值（A），计算PC-12 细胞存活率。
1.4 ROS 含量检测
对数生长期PC-12 细胞经胰酶消化、离心收集后制成细胞悬液，按1.2 项分组，分别滴在经过高压灭菌的盖玻片上，置于6 孔板中于50 mL/L CO2的37 ℃培养箱中培养，至细胞单层铺满玻片时，分别以200 μmol/L ATR、SIM 和CYA 处理细胞24 h 进行干预。弃去细胞培养液并向每孔中加入1 mL 终浓度为10 μmol/L 的DCFH-DA，37 ℃培养箱孵育20 min。用无血清DMEM 高糖培养基洗涤细胞3 次后，用激光共聚焦显微镜（200 倍）于488 nm 波长下观察并拍摄ROS 荧光照片，进行细胞计数和分析。
1.5 RT-PCR 检测PC-12 细胞中相关基因的相对表达情况
对数生长期PC-12 细胞按1.2 项分组，置于6 孔板中于50 mL/L CO2的37 ℃培养箱中培养，至细胞单层铺满玻片时，分别以200 μmol/L ATR、SIM 和CYA 处理24 h 后收集细胞，并用Trizol 法提取细胞RNA。用含有gDNA Eraser 的PrimeScriptRT 试剂盒逆转录合成cDNA，用SYBR Premix ExTaqⅡ试剂盒进行实时荧光定量检测，各基因引物序列见表1。RT-PCR 反 应 条 件：95 ℃10 min，1 cycle→95 ℃15 s，40 cycle→60 ℃1 min，40 cycle。以β-actin 作为内参，对每个样本基因表达数据进行标准化，获得至少3 次重现性良好的数据。并通过计算循环阈值CT值来确定基因的相对表达，目的基因mRNA 的相对表达=2-ΔΔCT，ΔΔCT=（CT实验组目的基因-CT实验组管家基因）—（CT对照组目的基因—CT对照组管家基因）。
表1 RT-PCR 的各基因引物序列Tab.1 Gene primer sequence
1.6 Western blotting 检测PC-12 细胞中相关蛋白的相对表达情况
对数生长期PC-12 细胞置于6 孔板中，按1.2 项分组，于50 mL/L CO2的37 ℃培养箱中培养，至细胞单层铺满玻片时，分别以200 μmol/L 的ATR、SIM和CYA 处理24 h 后收集细胞，提取总蛋白，将各组蛋白质量浓度调整为20 μg/μL进行凝胶电泳和转膜后，加入Bcl-2、Bax、p53和Caspase-3一抗稀释液（1∶1 000），4 ℃孵育过夜。隔天用TBST 洗膜3 次并加入二抗稀释液（1∶2 000），匀速震荡1 h。用TBST 和TBS 分别洗膜1 次后，用ECL 显色液进行显色，并对各泳道条带进行灰度扫描，得出相应的蛋白表达量。
1.7 统计学处理
采用SPSS 22.0 软件处理数据，结果用±s表示。组间差异和两两比较采用单因素方差和LSD-t检验分析，以P＜0.01 为差异具有统计学意义。
2.1 CCK-8 检测细胞存活率情况
与对照组相比，ATR 组、SIM 组 和CYA组细胞的存活率均明显下降（P＜0.01）；
与ATR 组相比，SIM 组和CYA 组细胞的存活率明显上升（P＜0.01）；
与SIM 组相比，CYA 组细胞的存活率明显上升，差异具有统计学意义（P＜0.01，图2）。
图2 CCK-8 检测均三氮苯类除草剂处理PC-12 细胞24 h 的存活率比较Fig. 2 CCK-8 detected the survival rate of PC-12 cells treated with triazine herbicides for 24 h
2.2 ROS 检测结果
与对照组相比，ATR 组、SIM 组和CYA 组细胞内ROS 活性均明显升高（P＜0.01）；
与ATR 组相比，SIM组和CYA 组细胞内ROS 活性明显下降（P＜0.01）；
与SIM 组相比，CYA 组ROS 活性明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01，图3）。
图3 ROS 试剂盒检测均三氮苯类除草剂处理PC-12 细胞24 h 的ROS 水平变化（A）及统计学分析（B）Fig.3 ROS level(A)and static analysis (B)in PC-12 cells treated with triazine herbicides for 24 h by ROS kit
2.3 PC-12 细胞中Bax、p53、Bcl-2 和Caspase-3 mRNA 的表达情况
RT-PCR 检测结果显示，与对照组相比，ATR组、SIM组和CYA组细胞内Bax、p53 和Caspase-3 mRNA 表达均升高，Bcl-2 mRNA 表达明显降低（P＜0.01）；
与ATR 组相比，SIM 组和CYA 组细胞内Bax、p53 和Caspase-3 mRNA 表达明显 降低，Bcl-2 mRNA 表达明显升高（P＜0.01）；
与SIM 组相比，CYA 组细胞内Bax、p53 和Caspase-3 mRNA 表达明显降低，Bcl-2 mRNA 表达明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01，图4）。
图4 均三氮苯类除草剂处理PC-12 细胞24 h 时RT-PCR 检测结果的比较Fig.4 The detection results of RT-PCR in PC-12 cells treated with triazine herbicides for 24 h
2.4 PC-12 细胞中Bax、p53、Bcl-2 和Caspase-3 蛋白表达
Western blotting 检测结果显示，与对照组相比，ATR组、SIM组和CYA组细胞内Bax、p53和Caspase-3蛋白表达均升高，Bcl-2蛋白表达均明显降低（P＜0.01）；
与ATR 组相比，SIM 组和CYA 组细胞内Bax、p53 和Caspase-3 蛋白表达均明显降低，Bcl-2 蛋白表达均明显升高（P＜0.01）；
与SIM 组相比，CYA 组细胞内Bax、p53 和Caspase-3 蛋白表达明显降低，Bcl-2 蛋白表达明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01，图5）。
图5 均三氮苯类除草剂处理PC-12 细胞24 h 时Western blotting 检测结果的比较Fig.5 Western blotting detection of PC-12 cells treated with triazine herbicides for 24 h
由于均三氮苯类除草剂具有潜在的生态毒性及环境蓄积性，在欧洲各国已被禁用，但在中国、美国等国家仍在使用[7]。研究表明，长期、低剂量暴露于除草剂如ATR、SIM、CYA，可导致相关神经退行性疾病如帕金森病、阿尔茨海默病和肌萎缩性侧索硬化症的发生，提示这类除草剂对神经系统具有潜在毒性[8-9]。
本研究结果表明，与对照组相比，ATR 组、SIM 组和CYA 组细胞的存活率均明显下降，SIM 组和CYA组细胞的存活率明显高于ATR 组，说明相同条件下ATR 对PC-12 细胞的生长抑制率最大，毒性作用最强。同时，研究表明，3 组细胞内ROS 活性均显著升高，以ATR 组ROS 水平最高，由于PC-12 细胞产生的内源性ROS 主要由NADPH 氧化酶合成，ROS 水平异常升高可导致细胞内出现氧化应激反应，加速自由基产物的增多并影响线粒体功能，促进细胞凋亡的发生[10-11]。
Bcl-2 作为主要的抗凋亡蛋白家族成员之一，目前，其抗凋亡机制主要如下：①拮抗促凋亡基因Bax；
②抑制促凋亡蛋白细胞色素C 自线粒体释放到胞质；
③阻止胞质中的细胞色素C 激活Caspase；
④有抗氧化及维持细胞内钙稳态等作用。Bcl-2 家族的促凋亡蛋白Bax 一般出现在胞质中，当细胞响应外界损伤或刺激等凋亡信号后，Bax 蛋白可与Bcl-2 形成异二聚体，抑制Bcl-2 的抗凋亡功能，使线粒体内膜的通透性降低，Bax 将重新定位于线粒体表面，进而激活Caspase 蛋白的信号级联反应，通过破坏线粒体膜的完整性发挥作用。研究发现，Bax/Bcl-2 的比例是对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素[12]。
同时，p53 作为Bcl-2 基因转录的负调控因子，也参与了细胞凋亡的发生和发展[13]。本研究结果表明，均三氮苯类除草剂可明显抑制PC-12 细胞存活，其中，以ATR 的 抑 制 作 用 最 为 明 显；
ATR、SIM 和CYA 处 理 后，PC-12 细 胞 内Bax、p53 和Caspase-3 mRNA 及蛋白表达均升高，Bcl-2 mRNA 及蛋白表达均明显降低。这说明均三氮苯类除草剂染毒可激活细胞的凋亡途径，引起PC-12 细胞的损伤和死亡。
然而，这3 种药物所表现出的毒性大小也有所不同的，这可能是由3 种药物分子结构中C-6 位置引入的侧链不同导致的。ATR 分子母核C-6 位置引入的侧链中有异丙基结构，分子脂溶性较强，容易透过细胞膜而产生毒性作用；
SIM 分子母核C-6 位置引入的侧链中含有乙基，脂溶性相对较弱，毒性作用也较弱；
CYA 母核C-6 位置引入的侧链中含有氰基，使分子的亲水性增加，因而增大了药物分子透过细胞膜的难度，发挥毒性作用的效果最弱[14-16]。
综上所述，均三氮苯类3 种不同除草剂对PC-12都具有明显的神经毒性作用，可激活细胞凋亡途径促进PC-12 细胞发生凋亡，其毒性强弱依次为ATR 最强，SIM 次之，CYA 最弱。本研究的初步结果将为深入研究均三氮苯类除草剂致多巴胺神经元的损伤机制奠定基础，为深入探讨农药类环境污染因素在神经退行性疾病中的作用提供了毒理学依据。
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