张新超，胡玉敬，田丛娜，魏强，赵剑，杨双臣，边艳珠
1河北省人民医院核医学科，石家庄 050051；
2河北省儿童医院CT磁共振科
整合素是由α亚基和β亚基两个亚单位形成的跨膜糖蛋白，属于细胞黏附分子家族，其在脊椎动物体内广泛表达并参与细胞黏附、增殖、分化、转移、凋亡等生物过程。整合素αⅤβ3是整合素家族中的一员，在肺癌、乳腺癌、神经源性肿瘤等恶性肿瘤的新生血管内皮细胞中高表达，在正常细胞内表达极低［1-3］。肿瘤细胞内整合素αⅤβ3的表达与肿瘤浸润、转移等恶性表型有关，且其表达量与肿瘤恶性程度以及转移浸润特征相关，因此整合素αⅤβ3的表达水平可用于评估肿瘤的预后及评价治疗效果。精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸多肽（RGD）是整合素αⅤβ3受体的天然配体，99Tcm-3PRGD2是新型RGD显像剂，以双价形式与整合素αⅤβ3受体相结合，是一种基于氨基酸代谢显像的示踪剂。99Tcm-3PRGD2对肿瘤的诊断表现出较高的特异度及灵敏度，尤其是在肺癌、乳腺癌的研究中已经取得初步进展［4］，但关于其在骨转移瘤的诊断及疗效评价中价值的报道较少［5］。本研究组已在前期研究中对99Tcm-3PRGD2单光子发射计算机断层（SPECT）显像在骨移植瘤诊断中的价值进行 了 阐 述［5］，2017年1月—2021年12月，我 们对99Tcm-3PRGD2SPECT显像在乳腺癌骨移植瘤大鼠放疗疗效评价中的价值进行了分析，以期为99Tcm-3PRGD2SPECT显像评估骨转移瘤放疗效果奠定实验基础。
1.1 主要材料体质量140～160 g清洁级雌性Wistar大鼠2只、体质量200～250 g清洁级雌性Wistar大鼠50只均购自河北医科大学实验动物中心，Walker 256大鼠乳腺癌细胞购自河北医科大学实验中心。3PRGD2试剂盒由北京大学同位素中心提供，SPECT/CT仪为美国通用电气公司Discovery 670 SPECT/CT仪，99Mo-99Tcm发生器购于北京原子高科技术有限公司。
1.2 动物建模与分组处理在2只体质量140～160 g的Wistar大鼠腹腔内接种Walker 256大鼠乳腺癌细胞，用于乳腺癌细胞增殖。1周后大鼠腹部膨隆，用无菌注射器抽取含有大鼠乳腺癌细胞的腹水并置于无菌离心管中1 500 r/min离心3 min，丢弃上清液后加入0.9 %无菌生理盐水稀释，调整细胞浓度至1.0×108/mL备用。分别将50只体质量200～250 g雌性Wistar大鼠于左后胫骨（距胫股关节面1.5 cm）处钻取约1 mm2小孔，使用微量注射器向大鼠骨髓腔内注入5 μL制备好的腹水混悬液（约5.0×105个肿瘤细胞）［6-7］。造模后第10、20及30天分别行大鼠胫骨CT扫描（管电压120 kV，管电流100 mA，重建层厚0.625 mm）。成瘤标准［8］：CT示骨髓腔内出现密度减低区及骨皮质断裂、缺损。50只大鼠最终成瘤30只（5只死亡、15只未成瘤），成瘤率60%。将成瘤大鼠按照随机数字表法随机分为对照组、低剂量放疗组、高剂量放疗组各10只，分别于骨移植瘤部位行直线加速器放疗，放疗方式为单次大剂量放疗，剂量分别为0 Gy、5 Gy、25 Gy［9］。
1.399Tcm-3PRGD2的制备及放射化学纯度检测
将2 mL Na99TcmO4淋洗液加入到3PRGD2冻干品中进行标记并充分摇匀，将标记好的99Tcm-3PRGD2与大鼠血清混合于无菌安培瓶内，置于37℃水浴锅内保温，采用薄层纸层析法测定混合液1、2、4、6 h的放射化学纯度。37℃温育下混合液1、2、4、6 h的99Tcm-3PRGD2放射化学纯度分别为97.6%、97.2%、96.1%、95.4%，均大于95%，提示99Tcm-3PRGD2制备成功。
1.4 骨移植瘤99Tcm-3PRGD2SPECT显像及图像分析各组分别于放疗前及放疗结束后第10天尾静脉注射99Tcm-3PRGD2（0.2 mL，74 MBq），1 h后 行SPECT平面显像［10］。采用GE Discovery 670 SPECT/CT仪进行SPECT显像，探测器距离大鼠约3 cm，设置能峰140 keV，窗宽-20%～+20%，矩阵256×256，放大倍数2.0，采集时间15 min。采用Xeleris软件进行图像分析。由2名5年以上核医学诊断经验的副主任医师联合分析图像，计算骨移植瘤部位放射性计数与对侧相应部位同等大小区域的放射性计数比值（T/NT），感兴趣区约20 mm2，每个部位重复测量5次，取其平均值作为最终结果。
1.5 胫骨组织病理观察采用HE染色。放疗后第10天显像结束后处死大鼠，截取各组大鼠胫骨组织，经固定、脱钙处理后，石蜡包埋，切片，加入苏木素染液染色，分化液分化，返蓝液返蓝，梯度乙醇脱水，伊红染液染色，脱水封片，显微镜下观察胫骨组织病理改变。
1.6 骨移植瘤组织整合素αⅤβ3受体表达情况观察采用免疫组织化学法。取各组大鼠骨移植瘤组织，冲洗、固定、脱钙、石蜡包埋、切片，对肿瘤组织切片进行整合素αⅤβ3受体免疫组化染色，计算阳性细胞所占比例。
1.7 统计学方法采用SPSS21.0统计软件。计量资料行Bartlett方差齐性检验与Kolmogorov-Smirnov正态性检验，具备方差齐性且服从正态分布的计量资料以±s表示，多组数据比较行单样本方差分析，组间两两比较行SNK检验；
T/NT与αⅤβ3受体阳性细胞表达的关系采用Spearman相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 各组99Tcm-3PRGD2SPECT显像剂浓聚程度及T/NT比较各组放疗前行99Tcm-3PRGD2SPECT显像，骨移植瘤部位均可见显像剂浓聚影，浓聚程度无明显差异（OSID码图1）；
对照组、低剂量放疗组、高剂量放疗组放疗前T/NT分别为3.70±0.30、3.87±0.24、3.96±0.26，各组放疗前T/NT比较无统计学差异。各组放疗后第10天行99Tcm-3PRGD2SPECT显像，病灶区域仍可见显像剂浓聚，视觉观察对照组显像剂浓聚程度较前增加，低剂量放疗组、高剂量放疗组显像剂浓聚程度均较前明显减低，其中高剂量放疗组减低程度更明显（OSID码图2）；
对照组、低剂量放疗组、高剂量放疗组放疗后第10天T/NT分别为4.03±0.33、3.51±0.31、2.00±0.28，对照组＞低剂量放疗组＞高剂量放疗组（P均＜0.05）。
2.2 各组胫骨组织病理学变化比较HE染色显示，三组胫骨组织内均可见骨结构破坏，周围散在肿瘤细胞，血管、神经结构消失，符合骨肿瘤表现。对照组内肿瘤细胞密度明显高于低剂量放疗组和高剂量放疗组，低剂量、高剂量放疗组内可见大量肿瘤细胞坏死，其中高剂量放疗组肿瘤细胞坏死更多。
2.3 各组骨移植瘤组织整合素αⅤβ3受体阳性率比较对照组、低剂量放疗组、高剂量放疗组骨移植瘤组织整合素αⅤβ3受体阳性率分别为67.12%±5.86%、42.96%±7.07%、32.41%±4.17%，对照组＞低剂量放疗组＞高剂量放疗组（P均＜0.05）。
2.4 T/NT与αⅤβ3受体阳性细胞表达的相关性Spearman相关性分析显示，T/NT与αⅤβ3受体阳性细胞表达呈正相关（r=0.847，P＜0.01）。
乳腺癌是女性好发肿瘤之一，骨骼是乳腺癌常见转移部位，骨转移往往预示肿瘤预后不佳。整合素αⅤβ3广泛参与细胞间黏附和信号传导，在肿瘤的转移、侵袭方面起重要作用。99Tcm-3PRGD2特异性结合细胞表面的整合素αⅤβ3受体，并可以进行SPECT显像。该技术可以用于对肿瘤新生血管的探测，并能够对肿瘤微环境及形态的变化进行早期微观及宏观的评估。
乳腺癌肿瘤细胞表面高表达整合素αⅤβ3，这是99Tcm-3PRGD2SPECT显像对乳腺癌进行诊断、治疗效果评价的基础。在以往的研究中，99Tcm-3PRGD2SPECT被发现对肺癌原发灶和骨转移病灶具有良好的诊断性能［11］，但其用于评价骨移植瘤疗效的报道国内外均少见。此外，有研究发现99Tcm-3PRGD2SPECT显像对肺癌骨转移诊断价值高于99Tcm标记的亚甲基二膦酸盐（99Tcm-MDP）SPECT，尤其是对溶骨性病变［12］。究其原因可能与99Tcm-3PRGD2SPECT显像主要反应肿瘤活跃程度有关，而不是反应骨盐代谢水平。整合素αⅤβ3成像还可以准确识别具有低18F-FDG摄取的肿瘤，但其机制目前尚不明确［13］。99Tcm-3PRGD2SPECT显像诊断和评价骨移植瘤的优势主要体现在以下两点：第一，显像主要针对肿瘤新生血管的探测，对骨折、骨质退行性变等良性疾病往往表现为阴性，从而降低了假阳性率；
第二，对单纯溶骨性病变表现出较高的灵敏度，即诊断溶骨性病变较好，因其不依赖骨盐的代谢水平，而是反应肿瘤的负荷程度，从而比常规的核素骨显像更具优势。
本研究结果显示，放疗前各组骨移植瘤显像剂浓聚程度及T/NT比较均无统计学差异。放疗后对照组显像剂浓聚程度明显高于高、低剂量放疗组，且低剂量放疗组显像剂浓聚程度高于高剂量放疗组。三组T/NT比较对照组＞低剂量放疗组＞高剂量放疗组，与显像剂浓聚程度等同。通过HE染色能够观察到各组大鼠骨胫骨组织均有不同程度肿瘤细胞浸润，并可见骨质结构破坏，对照组肿瘤细胞浸润尤其明显，而高剂量放疗组坏死肿瘤细胞较多。骨移植瘤组织αⅤβ3免疫组化提示三组均可见整合素αⅤβ3受体阳性细胞表达，且对照组阳性细胞表达量最高、低剂量放疗组次之、高剂量放疗组最低。放疗后，肿瘤细胞坏死，整合素αⅤβ3表达量下调，且随着放疗剂量的增加，整合素αⅤβ3表达量进一步降低，99Tcm-3PRGD2SPECT显像剂浓聚程度及T/NT亦同步下降。Spearman相关性分析显示，T/NT与αⅤβ3受体阳性细胞表达呈正相关。上述结果提示，99Tcm-3PRGD2SPECT显像可以较准确地对大鼠乳腺癌骨移植瘤放疗疗效进行评估。
综上所述，利用99Tcm-3PRGD2SPECT显像对大鼠乳腺癌骨移植瘤放疗疗效进行评价的效果良好，且99Tcm-3PRGD2具有易标记、稳定性好的特点，临床实用性较高。但本实验尚有不足之处，首先本研究中大鼠乳腺癌移植瘤成瘤率仅为60%，且大鼠骨移植瘤和真实的骨转移瘤尚有区别；
其次本研究没有与其他影像学方法进行比较，如99Tcm-MDP骨显像、18F-FDG PET显像等，这也是我们日后进行对比研究的方向。