[摘要] 目的 探讨CYP17基因启动子区域-34bp处T→C碱基置换与多囊卵巢综合征(PCOS)患者高睾酮(T)形成的关系。方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)及电泳分离技术检测177例PCOS患者及159例正常对照妇女CYP17基因启动子区域-34bp处碱基置换及其分布，比较PCOS患者及正常对照妇女CYP17基因多态及其与高T之间的关系。结果 PCOS组血清T、黄体生成素(LH)、黄体生成素/卵泡刺激素比值(LH/FSH)均显著高于对照组(P＜0.001)；各基因型A1A1、A1A2、A2A2及A1、A2等位基因在PCOS组与对照组间分布无统计学差异(P＞0.05)；PCOS各基因组的T值均高于对照组，且PCOS组A2A2型T水平显著高于另两型(P＜0.05)，突变组T水平亦显著高于无突变组T水平(P＜0.05)。结论 CYP17基因启动子区域-34bp处T→C碱基置换与PCOS 高T之间有一定的相关性，可能是PCOS的重要致病基因之一。
[关键词] 多囊卵巢综合征 基因 CYP17 多态性
[中图分类号] R34[文献标识码] A[文章编号] 1005-0515（2011）-08-025-03
Study on the Relationship Between the Polymorphisms in CYP17 Gene and Polycystic Ovary Syndrome in Jining City
Zhao ChangxingWang Fang
(Family Planning Service Stations of Jinxiang County in Jining, Jining,Shangdong,272200)
[Abstract] Objective To explore the relationship between the T→C substitution of -34bp of the promotor of CYP17 gene and the pathogenesis of high testosterone homone in patients with polycystic ovary syndrome(PCOS) in Jining city.Methods 177 cases of PCOS and 159 nomal women as controls were studied in Jinxiang family planning service stations and the Affiliated Jinxiang Hospital of Jining Medical College from July 2007 to July 2010. Polymerase chain reaction and electrophoresis on polyacrylamidegel were employed to detect the T→C substitution of -34bp of the promotor of CYP17 gene and its distribution.At the same time, the relationship between the mumations and high T of PCOS were compared. Results The levels of T、LH and LH/FSH were higher in PCOS group than in control group(P＜0.001);The prevalence rate of CYP17 genotype A1A1, A1A2,A2A2 and A1 and A2 in controls group respectively, Neither the genotype distributions nor the allele frequencies were statistically different between the two groups(P＞0.05);In PCOS group,the T levels of the genotype A2A2 group were statistically higher(P 1.3 主要仪器及试剂 Taq DNA聚合酶，dNTP，50 bp DNA、100bp DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司，限制性内切酶MspA1I购自美国Promega(普洛麦格)公司, 引物由上海博亚生物技术工程有限公司合成。PCR扩增仪由德国Eppendorf(艾本得)公司生产。
1.4 方法
1.4.1 DNA抽提 于月经第2-3天或闭经患者任何时期，抽取外周静脉血5ml，取500μl全血，用EDTA抗凝，用DNA提取试剂盒按药盒说明进行操作，无水乙醇沉淀，提取基因组DNA，自然干燥后-20℃保存备用。
1.4.2 内分泌指标检测 所有参与者均在月经周期的第1-3天抽取肘静脉血，用化学发光法测定卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、睾酮(T)水平。
1.4.3 引物设计 参照文献[6]报道的序列设计引物。引物1：5’-CATTCGCACTCTGGAGTC-3’,引物2：5’-AGGCTCTTGGGGTACTTG -3’, 扩增CYP17基因含-34bp多态位点的一段DNA，片段大小为419bp。
1.4.4 PCR反应 反应体系25μl，含基因组DNA0.7μl，25mmol/L Mgcl21.5μl，2.5 mmol/L dNTPs 2μl, 50pmol/μl引物各0.25μl,Taq DNA聚合酶(5U/μl)1.5μl。循环条件：94℃，预变性5min, 94℃ 1min, 66.2℃1min, 72℃1min, 35个循环；最后72℃延伸10min。
1.4.5 电泳分离DNA片断 先经10g/L琼脂糖凝胶电泳显示扩增效果, 然后以限制性内切酶MspA1I酶切 PCR扩增物，取酶切产物于3%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色，紫外投射反射仪下观察、摄像并保存，50bpDNA Marker作参照。CYP17基因-34bp处T→C的碱基置换后产生一个MspA1I酶的酶切位点，因此MspA1I酶切扩增产物后，正常无碱基置换者(A1A1)无酶切位点，仍为419bp；T→C碱基置换纯合子(A2A2)含一个酶切位点形成295bp和124bp 2个片段；杂合子(A1A2)形成419 bp、295bp和124bp 3个片段。
1.5 统计学处理 SPSS13.0软件包进行统计分析，用方差分析t检验比较组间性激素水平、BMI、年龄等，x2检验比较基因突变率、基因型频率和等位基因频率。检验水准：a=0.05。
2 结果
2.1 PCOS组与对照组年龄、BMI、和基础性激素水平比较 PCOS组T、LH、LH/FSH均显著高于对照组(P＜0.01)。两组间FSH、PRL、E2和BMI差异无统计学意义，PCOS组较对照组稍年轻，两组之间年龄无统计学差异(P＞0.05)，见表1
表1PCOS与对照组年龄、BMI和性激素比较（X±S）
2.2 CYP17基因经MspA1 I酶切后的基因型和等位基因频率分布 CYP17基因型A1A1、A1A2和A2A2频率分布在PCOS组与对照组间无统计学差异(P＞0.05)。A1、A2等位基因频率分布PCOS组与对照组间无统计学差异(P＞0.05)，见表2
表2PCOS组与对照组CYP17基因型和等位基因频率比较
2.3 PCOS组和对照组CYP17各基因型间睾酮(T)水平比较 PCOS组CYP17 A2A2型T水平显著高于A1A2型和A1A1型(P＜0.05),并且含A2等位基因组(突变组)的T水平(1.85±0.42) nmol/L显著高于不含A2等位基因组(无突变组)的T水平(1.41±0.55)nmol/L (P＜0.05)。对照组CYP17各基因型之间的T比较,差异无统计学意义(P＞0.05)。PCOS各基因型组的T值均高于对照组相应基因型组的T值，见表3。
表3PCOS和对照组各基因型间睾酮(T)水平(nmol/L)比较
注:※与A1A1组比较, P＜0.05; △与A1A2组比较, P＜0.05;a与对照组比较, P＜0.05。
3 讨论 越来越多的证据证明PCOS具有一定的遗传学基础,而且PCOS临床表现的多样性提示它可能有多种基因参与其发病[7]，高雄激素血症是PCOS突出的临床特征，参与合成类固醇激素合成的酶活性的改变可能是PCOS高雄激素形成的原因之一。
P450c17a是卵巢和肾上腺雄激素合成的限速酶,具有17a-羟化酶和17,20-裂解酶双重活性,在雄激素的生物合成中起着重要的作用。Rosenfield等[8]用GnRH(促性腺激素释放激素)类似物nafarelin对高雄激素血症和PCOS妇女进行研究，结果发现高雄激素血症和PCOS患者肾上腺和卵巢对GnRH类似物敏感性增加，并且P450c17a酶活性增强与雄激素的过度合成和分泌有关。用ACTH(促肾上腺皮质激素)做肾上腺刺激试验和长效GnRH类似物triptorelin做卵巢刺激和抑制试验，结果表明大部分高雄激素血症的妇女卵巢和肾上腺P450c17a活性增高[9].而且，与非高雄激素血组对比，PCOS妇女卵泡膜细胞中P450c17a表达和活性增高。因此，P450c17a活性增高在PCOS高雄激素血症的发生中起重要作用。该酶由CYP17(17a-羟化酶/17,20-裂解酶)基因编码，CYP17基因的突变或变异将可能导致P450c17a酶活性的提高，从而增加卵巢或肾上腺雄激素的分泌。
CYP17基因位于染色体10q24.3，在其翻译位点上游-34bp处含有一个T→C碱基置换多态性位点。Dinamanti-Kandarakis等[1]对希腊50名PCOS患者和相同数量的对照妇女研究发现, T→C的碱基置换与高雄激素血症密切相关, PCOS患者A2A2基因型的血清T水平高于A1A2组和A1A2组，认为CYP17基因-34bp处T→C碱基置换引起该基因的表达异常，导致P450c17a酶活性增加，进而导致PCOS高雄激素血症的形成。Marszalek等[4]亦发现PCOS患者纯合C等位基因表现为血清睾酮水平的升高。但也有研究认为CYP17基因在-34bp处T→C的碱基置换与PCOS高雄激素血症无关[10]。Gharani等[10]研究发现, PCOS患者基因型分布与健康对照妇女无统计学差异, 与高雄激素血症亦无关联性。Kahsar-Miller 等[11]在扩大样本后的研究结果与Gharani等[10]研究结果一致。
本研究结果显示，CYP17基因型A1A1、A1A2和A2A2频率分布在PCOS组与对照组间无统计学差异，A1、A2等位基因频率分布PCOS组与对照组间无统计学差异。PCOS患者中A2A2组T水平显著高于A1A2和A1A1组，含A2等位基因组的T水平显著高于不含A2等位基因组，与文献[4]报道相符，对照组CYP17各基因型之间的T比较,差异无统计学意义，说明A2等位基因的存在与PCOS高雄激素血症之间有一定的关联性。CYP17基因5，端调节区包含4个CCACC Sp1识别位点，一般认为调节区转录因子识别组件的数目与该基因启动子区域活性有关，而-34bp处T→C碱基置换则产生一个新的Sp1识别组件(CCACT→CCACC)，从而引起该区域转录活性升高，P450c17a酶活性增高，导致雄激素合成增多，因此从分子遗传学的角度可以揭示PCOS患者高睾酮血症可能的发病机制之一。国内曹云霞等[12]研究也发现，PCOS患者高雄激素血症组中A2等位基因的频率显著高于无高雄激素血症组，认为CYP17基因多态对于高雄激素血症的形成有重要的辅助作用。本研究发现CYP17基因型分布及等位基因分布在PCOS组和对照组间无明显差异，不同的是，国外Garey等[3]研究发现,正常对照人群含A2等位基因的A1A2基因型分布频率也很高,可能因CYP17基因型分布存在种族和地域差异。因此结合文献报道，我们认为CYP17基因-34bp处的碱基置换很常见，A2等位基因可能增加P450c17a酶活性，与PCOS 高T之间有一定的相关性，可能是PCOS的重要致病基因之一。
参考文献
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