[摘要]目的:探讨自制中药醇提物对瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)Ⅰ型胶原蛋白、基质金属蛋白酶1(MMP-1)及血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响。方法:在体外培养KFB中加入500μg/ml自制中药醇提物,采用免疫细胞化学方法检测KFB中Ⅰ型胶原蛋白、MMP-1及VEGF的表达。结果:在自制中药醇提物的作用下,KFB中Ⅰ型胶原蛋白表达减弱,MMP-1表达增强,VEGF表达呈双向性改变。结论:自制中药可能通过影响KFB合成Ⅰ型胶原蛋白、MMP-1及VEGF而发挥治疗瘢痕疙瘩的作用。
[关键词]瘢痕疙瘩;中医药;成纤维细胞;Ⅰ型胶原蛋白;基质金属蛋白酶1;血管内皮细胞生长因子
[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455(2010)03-0341-04
Effects of alcohol extractant from self-made traditional Chinese drug on expressions of typeⅠcollagen, matrix metalloproteinase 1 and vascular endothelial growth factor in keloid-derived fibroblasts
ZHAO Qing-li,MENG Ru-song,YANG Qing-qi,CAI Rui-kang
(Department of Dermatology,Air Force General Hospital of Chinese PLA,Beijing 100036,China)
Abstract:ObjectiveTo study the effects of the alcohol extractant from the self-made traditional Chinese drug on the expressions of typeⅠcollagen, matrix metalloproteinase 1 and vascular endothelial growth factor in keloid-derived fibroblasts(KFB).MethodsThe alcohol extractant from the self-made traditional Chinese drug at concentration of 500μg/ml was added to the cultured KFB. Immunohistochemistry was applied to detect the expressions of typeⅠcollagen, matrix metallo- proteinases 1 and vascular endothelial growth factor in KFB.ResultsAfter the extractant from drug taking action, the expression of type collagenⅠwas suppressed, the expression of MMP-1 was enhanced while the expression of VEGF was increased or decreased.ConclusionsThe self-made traditional Chinese drug may produce therapeutic effects by influencing the synthesis of typeⅠcollagen, MMP-1 and VEGF.
Key words:keloid, traditional Chinese drug; fibroblast, typeⅠcollagen; matrix metalloproteinase 1;vascular endothelial growth factor
瘢痕疙瘩(Keloid, K)的组织病理学特征为真皮中胶原纤维致密增生、排列紊乱。研究表明,K形成与胶原蛋白的合成与降解失衡有关;K组织中的微血管状况影响着K的发生、发展及转归。Ⅰ型胶原蛋白是K胶原组织中的主要成分,基质金属蛋白酶1(Matrix Metalloproteinases 1, MMP-1)是降解Ⅰ型胶原蛋白的关键酶。血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)为血管内皮细胞特异性丝裂原,在血管的形成、发育、分化等方面发挥着重要作用。本研究检测自制中药醇提物对K成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白、MMP-1及VEGF表达的影响,其目的是探讨药物的作用机制,为K临床治疗提供实验依据。
1材料和方法
1.1 材料:自制中药由全蝎、蚤休、丹参、生乳香、浙贝母、生甘草组成。体外培养的人K成纤维细胞(Keloid Fibroblasts, KFB)6株、人正常皮肤成纤维细胞(Normal Fibroblasts, NFB)3株由中国医学科学院整形外科医院王春梅教授赠送。主要试剂及仪器包括兔抗人Ⅰ型胶原蛋白、MMP-1、VEGF多克隆抗体(武汉博士德公司)、二步法免疫组化检测试剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)、DMEM、新鲜小牛血清、正常羊血清、正常兔血清。
1.2 实验方法
1.2.1 药物制备:90g自制中药粉碎为细粉,加8倍量75%乙醇回流提取,滤过,浓缩,用乙醇溶解为100ml,密闭冷藏。量取适量的自制中药醇提物水浴蒸干,加二甲基亚砜及PBS溶解,微孔滤膜滤过除菌,用细胞培养液(含DMEM、新鲜小牛血清、青霉素、链霉素)稀释成实验浓度。
1.2.2 细胞培养及免疫细胞化学染色:根据增殖实验结果,选择对成纤维细胞增殖无显著抑制作用的药物浓度(500 μg/ml)。KFB、NFB传代3～7代,加0.25%胰蛋白酶消化,制成1.5×105/ml细胞悬液,以2ml/孔(3×105细胞/孔)加入内含消毒盖玻片的6孔板中,培养箱中孵育48h。吸除原培养液,中药组加自制中药醇提物培养液2ml于KFB孔中,阴性对照组加单纯培养液2ml于KFB孔及NFB孔中,继续孵育48h。取出盖玻片,冷丙酮固定,1:15正常羊血清作用30min,分别滴加兔抗人Ⅰ型胶原蛋白(1:50)、MMP-1(1:100)、VEGF(1:50)多克隆抗体,同时设PBS对照及正常兔血清对照。4oC湿盒中过夜,复温,滴加通用型IgG(Fab段)-HRP多聚体,37℃作用30min,DAB显色,复染,脱水,封片。取硬皮病、恶性黑素细胞瘤、子宫内膜石蜡切片各1份,分别进行Ⅰ型胶原蛋白、MMP-1、VEGF免疫组化染色,以此设为阳性对照。
1.2.3 结果判定:显微镜下观察到Ⅰ型胶原蛋白、MMP-1、VEGF阳性表达呈棕褐色,细胞浆和/或细胞核内含棕褐色颗粒的细胞为阳性细胞。随机计数5个高倍镜视野(×400)中细胞总数及阳性细胞数,并换算成阳性细胞百分计数。
1.3 统计学分析:将所有资料输入数据库,采用SPSS 13.0软件进行统计学处理,检测指标用x±s表示,统计分析方法为t检验。P
2结果
硬皮病真皮网状层可见Ⅰ型胶原蛋白呈片状棕褐色着色。恶性黑色素瘤胞浆、核质中见MMP-1呈颗粒状棕褐色着色。子宫内膜血管内皮细胞胞浆内见VEGF呈弥漫性棕褐色着色。PBS对照及正常兔血清对照均未见棕褐色着色。
2.1成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白表达:阴性对照组KFB(图1)、NFB及中药组KFB(图2)均见胞核核膜上呈线状及核质中呈核仁样分布的较多Ⅰ型胶原蛋白阳性颗粒。阴性对照组KFB胞浆中见大量散在分布的阳性颗粒,阴性对照组NFB及中药组KFB胞浆中仅见少数散在的阳性颗粒。胞浆中阳性颗粒的表达强度为:阴性对照组KFB>中药组KFB≌阴性对照组NFB。阳性细胞百分计数在阴性对照组KFB与NFB间、阴性对照组与中药组KFB间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。
2.2 成纤维细胞MMP-1表达:三组MMP-1阳性表达均以胞核为主。阴性对照组KFB(图3)多数胞核呈阴性反应,少数胞核中见阳性细颗粒、粗颗粒排列于核周或/及散在分布于核质中;阴性对照组NFB及中药组KFB(图4)多数胞核呈阳性反应,阳性颗粒粗大甚至呈团块状,散在分布于核质中或聚集于核质的一侧。阴性对照组KFB胞浆中阳性颗粒少见,阴性对照组NFB及中药组KFB胞浆中均见少数散在分布的阳性颗粒。阳性颗粒的表达强度为:中药组KFB≌阴性对照组NFB>阴性对照组KFB。阴性对照组KFB的阳性细胞百分计数低于阴性对照组NFB,差异有统计学意义(P0.05) (表1)。 2.3 成纤维细胞VEGF的表达:阴性对照组KFB(图5)、NFB多数胞核、胞浆中均见VEGF阳性颗粒,呈细颗粒、粗颗粒状散在分布于核质中或/及胞浆中,以胞核为主。中药组KFB(图6A 6B)部分细胞阳性表达减弱,表现为胞核中少数散在的核仁样颗粒,胞浆中呈阴性反应或仅见少数散在的阳性细颗粒;部分细胞阳性表达增强,表现为胞浆中大量散在分布的阳性粗颗粒,或大量阳性细颗粒聚集于核周。阳性颗粒的表达强度为:中药组KFB表达增强区>阴性对照组KFB≌阴性对照组NFB>中药组KFB表达减弱区。中药组KFB的阳性细胞百分计数低于阴性对照组KFB,差异有统计学意义(P0.05)(表1)。
3讨论
K组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的含量明显增加,尤以Ⅰ型胶原为甚。Ⅰ型胶原蛋白的合成受诸多因素影响,直接检测体外培养的KFBⅠ型胶原蛋白的表达可以避免许多内在因素的干扰,显现KFB本身所固有的特性。为了能准确地判定自制中药醇提物对成纤维细胞合成Ⅰ型胶原蛋白的影响,避免药物抑制细胞增殖的干预,本研究选择对成纤维细胞增殖无显著抑制作用的药物浓度。我们的结果表明,KFB合成Ⅰ型胶原蛋白增加,表现为胞浆中有大量的阳性颗粒;自制中药醇提物可抑制KFB合成Ⅰ型胶原蛋白,表现为胞浆中阳性颗粒明显减少。然而,阳性细胞百分计数分析并未显示阴性对照组KFB与NFB间、阴性对照组与中药组KFB间统计学意义上的差异,我们认为这可能与三组成纤维细胞胞核上阳性表达无数量上的差异有关。
近年来,胶原蛋白合成与降解间的失衡在K形成中的作用引起国内外学者的重视。关于K组织细胞中MMP家族的检测与干预已成为当今研究的热点课题。MMP家族是一组蛋白水解酶类,它们对细胞外基质具有广泛的降解作用。MMP-1为其家族成员之一,它可以在Ⅰ型前胶原α1、α2链的特殊位点降解胶原,使其成为1/4～3/4片段。在创伤修复中MMP-1可表达于真皮成纤维细胞上,以参与肉芽组织的形成和清除以及瘢痕的消退[1]。国内有学者对K病理切片进行MMP-1免疫组化染色,结果显示K组织中MMP-1表达较正常皮肤显著增加[2]。鉴于成纤维细胞、巨噬细胞、上皮细胞等多种细胞均可产生MMP-1,我们认为检测K组织中MMP-1的表达并不能反映出成纤维细胞合成MMP-1的实际状况。本研究的MMP-1定性、定量分析结果显示,体外培养的KFB与NFB比较,其MMP-1表达显著降低,此结果与Arakawa等[3]、Uchida等[4]结论相符,提示KFB自身存在着MMP-1转录及/或翻译水平的异常,致使KFB胞核、胞浆中MMP-1蛋白减少。在我们的临床疗效观察中发现,自制中药软膏可使K萎缩、变平、退化(待发表)。本研究显示自制中药醇提物可使KFB中MMP-1蛋白增多,这表明本药物可能通过促进KFB合成MMP-1、以降解致密增生的胶原纤维,从而达到促使K消退的治疗效果。
关于K微血管状况在K发生、发展、转归中的作用已成为近年来学术界争论的焦点之一。部分学者强调,瘢痕组织血管生成过多、血供丰富支撑着瘢痕的过度增生。另有学者认为,瘢痕组织供血不足、组织缺氧诱发K;瘢痕内血管通路的建立、正常微循环的形成对瘢痕的退化有促进作用[5-6]。新近的研究表明,K部位不同,组织内微血管状况亦不同;浸润部微血管数量增加,老化部微血管数量减少[7]。多数文献支持K组织中VEGF表达增高[7-10],其主要分布或真皮成纤维细胞上[7-8,10],或表皮角质形成细胞中[9];VEGF表达K浸润部>K周边正常皮肤≌K增生部>K老化部≌正常人皮肤[10]。由此可见,对于临床表现复杂多样的K皮损而言,单纯地促使或抑制血管增生均欠全面,须根据K皮损的不同表现分别采取相应的治疗。本研究结果显示,在培养液中生长的KFB其VEGF表达与NFB比较无明显差异,即KFB就单个细胞而言无VEGF合成增多。我们推测以往学者检测到的KFB上VEGF高表达可能与组织中的微环境及相关因子的作用有关,或与组织中KFB增多有关。KFB在自制中药醇提物的作用下,虽与阴性对照组比较其VEGF阳性细胞百分计数显著减少,但却同时显现VEGF表达明显减弱及显著增强,即表明该药物对KFB VEGF的合成具有双向调节作用,可使部分KFB合成VEGF增多而部分KFB合成VEGF减少,这是否意味着K组织中存在着具有不同VEGF合成机制的成纤维细胞,是否意味着调动成纤维细胞的这种双向反应以促进及抑制血管增生对K的治疗更有益,尚需要进一步研究。
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[收稿日期]2009-11-21 [修回日期]2010-02-06
编辑/张惠娟