[摘要]目的：本研究观察血管紧张素Ⅱ(angiotens in Ⅱ，Ang Ⅱ)对增生性瘢痕成纤维细胞细胞外信号调节激酶(extracellularsignal－regulated kinase，ERK)活性的影响，旨在探讨其影响增生性瘢痕成纤维细胞生物学行为的信号机制。方法：取自愿捐献的增生性瘢痕组织标本，采用胶原酶法行成纤维细胞培养。用免疫荧光组织化学法检测细胞AT1和AT2受体的表达。取第3－4代细胞，并按实验设计，分别加入10-2Tmol/L Ang Ⅱ，10-2mol/L Ang Ⅱ+10 μmol/L Valsartan，10-2mol/L Ang Ⅱ+10μ ol/L PDl23319，10~mol/L Val sartan，10μmol/L PDl2 3319共5组；对照组仅加入等量DMEM。以Western Blot法检测培养的细胞细胞外信号调节激酶(ext racellular signal－regulated kinases，ERK)活性变化，观察在阻断AT1或AT2受体情况下Ang Ⅱ对培养的瘢痕成纤维细胞ERK磷酸化的影响。结果：免疫荧光组织化学染色结果显示培养的增生性瘢痕成纤维细胞同表达AT1和AT2受体。Ang Ⅱ可增加培养的增生性瘢痕成纤维细胞ERK磷酸化。在一定剂量范围内，Ang Ⅱ浓度增加，细胞ERK磷酸化程度增加。与对照组比较10-7mol/L Ang Ⅱ显著增加瘢痕成纤维细胞ERK磷酸化，且差异有统计学意义(P＜0.05)。10μmol/L AT2受体拮抗剂PDl233191可显著增强Ang Ⅱ诱导的细胞ERK磷酸化(P＜0.05)；10μmol/L的AT1受体拮抗剂Val sartan可显著抑制Ang Ⅱ诱导的细胞ERK磷酸化；Valsartan或PD1233191单独刺激细胞并未明显影响ERK磷酸化(P＞0.05)。应用抗ERK抗体显示各组ERK含量一致。结论：Ang Ⅱ通过其受体AT1和AT2可调控增生性瘢痕成纤维细胞ERK磷酸化，Ang Ⅱ对增生性瘢痕成纤维细胞ERK活性的影响可能是Ang Ⅱ调控增生性瘢痕成纤维细胞生物学行为可能的信号机制之一。
[关键词]血管紧张素Ⅱ；增生性瘢痕；成纤维细胞；细胞外信号调节激酶；受体
[中图分类号]R619.6 R364.3 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)07－0874－04
研究表明，许多细胞因子在瘢痕形成中可改变在创伤修复中起重要作用的成纤维细胞的增殖与迁移，引起组织细胞对损伤的过度反应，导致瘢痕过度增生。因此研究细胞因子对成纤维细胞增殖、分化、演变及凋亡的调控，是目前研究增生性瘢痕形成机制的热门课题。最新的研究发现血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)是一个重要的致纤维化因子，且与皮肤的纤维增殖性病变有密切关系。我们最近也报道了Ang Ⅱ可促进增生性瘢痕成纤维细胞的增殖和胶原的合成，然而其影响增生性瘢痕成纤维细胞生物学行为的信号机制尚未阐明。本研究我们采用体外培养增生性瘢痕成纤维细胞，观察Ang Ⅱ对细胞外信号调节激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)活性的影响，旨在探讨其作用的分子机制。
1 材料和方法
1．1 主要材料和试剂：实验所需增生性瘢痕组织标本取自我科住院患者手术切除的增生性瘢痕组织。增生性瘢痕形成不超过一年，取材部位未经任何治疗，不伴有肿瘤或其他结缔组织疾病。未曾服用抑制血管紧张素系统的药物。
DMEM培养液和胎牛血清(美国Gibco公司)，胰蛋白酶(日本Wako公司)，Dispase(日本Sanko公司)。AT1受体阻断剂Valsartan，AT2受体拮抗剂PDl2339(日本三共公司)，抗细胞外信号激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)和pERK的抗体，兔抗人ATl受体多克隆抗体，羊抗人AT2受体多克隆抗体均购自Santa Cruz公司。德克萨斯红(Dexas Red)标记的鼠抗兔IgG，FITC标记的兔抗羊IgG均由第四军医大学全军神经科学研究所提供。
1．2 成纤维细胞培养：应用胶原酶法行成纤维细胞培养，用0.125％的胰蛋白酶消化传代。实验所用成纤维细胞为第3－4代。
1．3 免疫荧光组织化学检测AT1和AT2受体表达：利用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞中AT1和AT2受体表达情况。操作按试剂盒说明进行，将培养的细胞用40g/L多聚甲醛固定10min，PBS缓冲液洗涤，1％BSA封闭30min，分别加入工作浓度为1:50的相应抗体，4 ℃下保持在湿盒中孵育36h。洗涤后，加入两种荧光素混合液(工作浓度分别为FITC标记1:30，得克萨斯红标记1:100)，室温孵育3h。经得克萨斯红标记后，AT1受体呈红色荧光(激发波长514nm)，FITC标记后，AT2受体呈绿色荧光(激发波长488nm)当细胞同时标记到两种荧光素时则表现为黄色荧光。通过计算机采集共聚焦显微镜所得图像。
1．4 实验分组：选择生长状态良好3－4代的成纤维细胞，接种于24孔细胞培养板，2％血清培养液培养48h，无血清培养，实验组分为5组，并按实验设计分别加入10-7mol/L Ang Ⅱ，10-7mol/L Ang Ⅱ+10pμmol/L Valsartan，10-7mol/L Ang Ⅱ+10μmol/L PDl23319，10μmol/L Valsartan，10μmol/L PD123319，对照组仅加入等量的DMEM。于相同条件下继续培养。
1．5 Western blot分析细胞外信号激酶(extracellular signal－regulated kinase，ERK)活性：取各组细胞按试剂盒说明书操作。具体方法如下：实验终点取细胞溶解物、离心、提取总蛋白。取25μg蛋白，变性后上样于10％的聚丙烯酰胺凝胶，经电泳分离后，电转移到PVDF膜，加入一抗即：抗ERK或pERK的抗体(工作浓度1:1000)，加入辣根过氧化物酶结合的二抗，ECL化学法光试剂盒检测信号。通过美国NIH图像分析系统(美国国家卫生研究院研究服务中心)，对各条带的灰度值进行测定比较。每次实验重复3次。
1．6 统计学分析：数据以(均数±标准差)表示，统计处理应用SPSS软件，组间比较采用方差分析，两两比较用t检验，P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2．1培养的增生性瘢痕成纤维细胞Ang Ⅱ受体 AT1和AT2的表达：对培养的3－4代的增生性瘢痕成纤维细胞免疫荧光组织化学染色发现，增生性瘢痕成纤维细胞同时表达AT1和AT2受体，阳性标记主要位于细胞膜。AT1受体的阳性标记似乎较AT2受体阳性标记强。
2．2 Ang Ⅱ对增生性瘢痕成纤维细胞ERK磷酸化的影响：在无血清培养的条件下，AngⅡ(10-6mol/L)的刺激引起培养的增生性瘢痕成纤维细胞ERK磷酸化增加，在Ang Ⅱ刺激后5min，ERK磷酸化程度达到峰值。在一定剂量范围内，刺激物Ang Ⅱ浓度增加，细胞ERK磷酸化程度增加
2．3 AT1和AT2受体在Ang Ⅱ诱导的增生性瘢痕成纤维细胞ERK磷酸化中的作用：与对照组比较，1×10-7mol/L Ang Ⅱ显著增加成纤维细胞ERK磷酸化，且差异有统计学意义(P＜0.05)。10μmol/L AT2受体拮抗剂PD1233191与10-7mol/L Ang Ⅱ同时刺激成纤维细胞，PD123319l可显著增强Ang Ⅱ诱导的细胞ERK磷酸化，与单纯Ang Ⅱ组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；10μmol/L的AT1受体拮抗剂Valsartan与10-7mol/L Ang Ⅱ同时刺激细胞，Valsartan可显著抑制Ang Ⅱ诱导的细胞ERK磷酸化，与单纯Ang Ⅱ组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；Valsartan或PD1233191单独刺激细胞并未明显影响ERK磷酸化，应用抗ERK抗体显示各组ERK含量一致。
3 讨论
增生性瘢痕主要病理表现是成纤维细胞异常过度增殖、细胞胶原代谢异常导致细胞外基质过度沉积，其形成机制尚未完全阐明。目前研究已证明，细胞因子在瘢痕形成中起着重要作用。肾素一血管紧张素系统最重要的活性产物Ang Ⅱ作为一个重要的应激激素和多效应生长因子不仅在心血管和肾脏的纤维化病变中起重要作用，而且与皮肤的瘢痕形成和成熟关系密切。我们也曾报道了Ang Ⅱ通过其受体调节增生性瘢痕成纤维细胞生物学行为。然而其作用的细胞信号机制仍未阐明。ERK是哺乳类动物和无脊柱动物细胞中最早发现的丝裂素激活蛋白激酶家族的核心成员，是目前研究比较清楚的刺激转录增加的一条通路。该通路最主要的激活信号来自生长因子，通过改变靶蛋白的磷酸化在细胞生长、迁移及分化等信号传递中起重要作用。多种细胞因子包括Ang Ⅱ通过其受体可激活ERK，导致几个早期即刻基因c－fos、c－jun、erl－1等表达增加。陈伟等报道在增生性瘢痕组织中磷酸化ERK表达增加。刘传君等报道瘢痕疙瘩的成纤维细胞和正常皮肤的成纤维细胞ERK磷酸化程度明显不同阳。上述发现提示ERK通路的改变可能与增生性瘢痕成纤维细胞生物学行为改变有关。为进一步探索Ang Ⅱ影响增生性瘢痕成纤维细胞生物学行为的分子机制，本研究以观察Ang Ⅱ对瘢痕成纤维细胞ERK活性的影响为切入点，试图初步阐明其作用可能的信号机制。
本实验首先观察了Ang Ⅱ受体在培养的增生性瘢痕成纤维细胞中的表达。免疫荧光组织化学的检测结果显示增生性瘢痕的成纤维细胞同表达AT1和AT2受体蛋白，这个结果再次证实我们以前的发现。为弄清Ang Ⅱ如何调控增生性瘢痕成纤维细胞ERK的磷酸化，我们用药理学受体阻断的方法观察了Ang Ⅱ受体AT1和AT2在成纤维细胞ERK磷酸化中的作用。本实验我们发现Ang Ⅱ刺激可增加人增生性瘢痕成纤维细胞ERK磷酸化，用选择性AT1受体阻断剂Valsartan阻断AT1受体可抑制Ang Ⅱ诱导的成纤维细胞ERK磷酸化，用AT2受体拈抗剂PD123319阻断AT2受体可促进细胞ERK磷酸化，AT1受体介导的Ang Ⅱ的促牛长信号受到AT2受体否定的调控，这个实验结果提示：AngⅡ通过其受体AT1和AT2可调控增生性瘢痕成纤维细胞ERK磷酸化，Ang Ⅱ对成纤维细胞ERK活性的影响可能是Ang Ⅱ调控增生性瘢痕成纤维细胞生物学行为町能的信号机制之一。
已证实正常皮肤成纤维细胞和增生性瘢痕成纤维细胞生物学行为存在明显差异，我们前期的研究发现增生性瘢痕中Ang Ⅱ产生增加，AT1和AT2受体表达增加，而且Ang Ⅱ产生和受体表达的变化趋势与瘢痕的成熟过程密切相关。我们现在的研究再次证实，Ang Ⅱ作为一个致纤维化因子不仅在心血管系统起作用，同时也在皮肤瘢痕形成中起作用，同时提示Ang Ⅱ对细胞内的信号分子如ERK活性的调控可能是其影响增生性瘢痕形成可能的信号机制之一。这种调控作用可能是通过Ang Ⅱ产生量及其受体AT1和AT2表达量和表达比例的变化来实现的，通过抑制Ang Ⅱ产生、阻滞AT1受体或激活AT2受体，可导致下游信号通路，如ERK通路阻滞，可能对增生性瘢痕产生抑制作用，从而加快瘢痕的成熟。进一步研究需要在体内实验条件下验证上述可能的推测。
另外，神经、体液、内分泌在组织修复中的作用已引起国内外学者的重视。皮肤是一个激素敏感器官，义是Ang Ⅱ作用的靶器官之一。Ang Ⅱ作为细胞因了在局部组织起作用，同时也作为全身重要的几个激素系统中的一个发挥生理作用，它在机体组织损伤后的重建过程中的作用及其作用的信号机制是非常复杂的，需要在今后的研究中进一步深入探讨并加以揭示。
综上所述，本实验证实增生性瘢痕成纤维细胞同表达Ang Ⅱ受体蛋白AT1和AT2，Ang Ⅱ通过激活AT1和AT2受体对增生性瘢痕成纤维细胞ERK的磷酸化产生相反的调控作用，进而可能影响成纤维细胞的增殖及细胞外基质的产生。目前AT1受体阻断剂已商品化，并广泛用于心血管疾病的治疗，供药理学研究使用的AT2受体拮抗剂也已开发成功，现在的研究有可能为此类药物用于瘢痕的治疗或开发新的抗瘢痕药物提供线索。