[摘要]目的：探讨胞外Ca2+对人角质形成细胞(HKC)的增殖与分化的调控作用，为组织工程皮肤的研制提供依据。方法：HKC体外培养，应用形态学、免疫细胞化学、MTT等方法检测胞外Ca2+对HKC增殖与分化的影响，并利用钙通道阻滞剂SK&F 96365来研究其作用的可能途径。结果：Ca2+为0.5mmol/L时，HKC呈单层生长，免疫细胞化学显示HKC呈低分化状态，当Ca2+为1mmol/L与1.5mmol/L时，细胞在3天后出现复层生长，免疫细胞化学显示细胞K19角蛋白表达减少，Ca2+为2.0mmol/L时表现出一定的细胞毒性作用，SK&F 96365可逆转Ca2+的促增殖与分化作用。结论：胞外Ca2+在一定范围内具有促HKC分化与增殖的作用，并且该作用可以被SK&F 96365所阻滞。
[关键词]Ca2+；角质形成细胞；组织工程；钙通道阻滞剂
[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2007）09-1181-03
The regulative effect of Ca2+ on proliferation and differentiation of epidermal keratinocytes
SUN Qiang,CHAI Jia-ke,LIANG Li-ming,YANG Hong-ming,DU Jia-mei,WANG Li-huan
(Department of Plastic and Burns Surgery,First Affiliated Hospital,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100037,China)
Abstract:ObjectiveTo investigate the regulative effect of Ca2+ on growth and differentiation of keratinocytes which is the base of tissue engineering skin.MethodsKeratinocytes were cultured with H-KGM contained different levels of Ca2+ or Ca2+ entry blocker. The result were detected by morphology , immunocytochemistry and MTT assay for two weeks.ResultsThe cell were in monolayer in H-KGM at level of 0.5mmol/L Ca2+，However, as concentration of Ca2+ was 1mmol/L or 1.5mmol/L, cell grown up rapidly and became stratum after 1-3d of culture, the expression of keratin 19 decreased. We also found the cytotoxicity of 2.0mmol/L Ca2+, this effect was markly suppressedby Ca2+ entry blocker.ConclusionCa2+ can promote the proliferation and differentiation of kerationcyte, and this effect can be depressed by the Ca2+ entry blocker.
Key words: Ca2+ Keratinocyte;tissue engineer;Ca2+ entry blocker
随着组织工程研究工作的不断深入，更多的学者[1]认识到目前组织工程研究工作的重点是如何解决种子细胞的调控问题。HKC是构建组织工程皮肤重要的种子细胞，研究表明，HKC的增殖与分化是受多因素调节的复杂过程。Ca2+作为体内活跃的阳离子，参与了机体多种生理性与病理性活动，有资料[2]显示，Ca2+具有促表皮细胞增殖与分化的作用，但Ca2+对HKC的调节作用与其剂量之间具体的关系，以及钙通道阻滞剂对这种调节作用的影响仍存在众多争议。本文以体外培养的HKC为研究对象，观察Ca2+对其增殖与分化的影响，旨在为组织工程皮肤的研制与应用奠定一定的理论基础。
1材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验对象：HKC取自包皮环切术与烧伤整形植皮手术剩余皮片，患者知情同意。
1.1.2 试剂与药品：细胞培养所采用的H-KGM培养基、Dispase酶与胰酶均为Gibco公司产品，K19免疫组化试剂盒购于中杉金桥生物技术有限公司，MTT购于sigma公司，SK&F 96365为Biomol Research Lab Inc（USA）产品。
1.2 方法
1.2.1 HKC培养：参照《细胞培养》[3]中的方法并加以改进，取手术患者剩余皮肤，去除多余的皮下组织与部分真皮，剪成皮条，置于0.25%的dispase酶中4℃过夜消化；分离表皮与真皮，将剥离的表皮剪碎后置于0.25%胰蛋白酶与0.02%EDTA混合液中37℃消化5min；终止消化后用尼龙筛网过滤，离心后收集细胞，加入H-KGM，接种于培养瓶中，置37℃、5%CO2孵箱中培养及传代。
1.2.2 Ca2+对HKC体外生长的影响：①形态学观察：将第3代细胞按1×105接种24孔培养板，当其达到对数生长期时，按下列分组：对照组、低钙组、中钙组、高钙组、极高钙组分别将培养基更换为含Ca2+浓度为0mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L的H-KGM，并设置阻滞剂对照组与钙通道阻滞剂组，即SK&F 96365(10μmol/L)组与SK&F 96365(10μmol/L)+Ca2+(1.0mmol/L)组，继续培养2周，分别在1、2、4、6、8、11、14天行形态学观察并记录。②MTT法：将第3代HKC按1×103接种于96孔培养板（200μl/孔），当其达对数生长期时，按上述分组更换培养基，每组6孔，另外设空白对照，在第7天加入MTT后孵育4h，小心吸去上清液，加入150μl DMSO，震荡10min，于波长490处读取吸光度（OD值）平均值，计算细胞生存率： 细胞生存率=(OD实验组/OD对照组)×100%。
1.2.3 细胞组织化学：将表皮细胞接种于清洁消毒的盖玻片上培养24h，按上述分组更换培养基后继续培养，继续培养48h后按免疫组化试剂盒说明书进行操作，同时设立阴性与阳性对照组，
1.2.4 统计学分析：检测数据采用单因素方差分析及t检验进行统计学处理，统计软件为SPSS10.0。
2结果
2.1 形态学指标(如图1)：在无钙、低钙、及存在SK&F 96365条件下，细胞为单层铺路石样生长，以小细胞为主，细胞边缘清晰，除无钙条件下细胞增殖缓慢甚至停滞外，低钙组与钙通道阻滞剂组细胞增殖活跃，偶见分化变异的大细胞，低钙组在6天后细胞达100%融合，细胞内颗粒增多，局部细胞出现崩解现象。中钙组与高钙组在处理2～3天即出现改变，细胞出现成簇样生长现象，个别区域细胞轮廓不清，处理3天后在某些区域细胞出现复层生长现象，复层区域呈山丘样生长，7天后细胞广泛融合，边缘不清或消失，复层区域相互连接，形成广泛的复层结构。极高浓度组在处理1天后细胞即发生形态变化，与中钙组与高钙组处理2～3天相似，但2～3天后细胞即出现广泛融合，细胞边界消失，结构不清，部分细胞核崩解，处理4天后60%～70%细胞死亡或凋亡。
图1不同浓度Ca2+对体外培养HKC生长的影响（光镜×100倍）（A：在无钙H-KGM条件下培养5天后，HKC单层生长，克隆形成率较低，细胞基本不增殖； B：含0.5mmol/L Ca2+ 的H-KGM培养5天后，HKC单层生长，形成铺路石样外观；C：1mmol/LCa2+ 的H-KGM处理3天的HKC，局部细胞出现山丘样的复层结构； D：2mmol/LCa2+的H-KGM处理4天后显示HKC 细胞广泛坏死脱落）
2.2 细胞组织化学(如图2)：与对照组比较，中钙组与高钙组细胞表达K19角蛋白数量明显减少，阳性细胞率与对照组比较具有显著性差异。极高钙组细胞阳性率与低钙组比较差异无显著性，但细胞总量减少，钙通道阻滞剂组、阻滞剂对照组与对照组比较，无显著性差异。
2.3 MTT结果（如图3）：MTT结果显示，无钙条件下，细胞增殖缓慢，甚至停滞，低钙组、中钙组与高钙组的细胞生存率分别为409.62 %、442.31%、396.15%，与对照组比较P0.05，差异无显著性。在极高钙条件下，细胞生存率为30.77%，与对照组比较有显著性差异(P0.05)，钙通道阻滞剂组与中钙组比较（P2+是机体内具有活跃生物活性的阳离子，参与多种生理病理活动，如递质释放、心肌电位形成、信号传导等，同时有研究显示，Ca2+对多种细胞的增殖与分化具有十分重要的调节作用。
3.2本研究发现，Ca2+在一定范围内具有促HKC增殖作用，并且表现出一定的剂量-效应依赖关系，当Ca2+在0～1.0mmol/L之间变化时，细胞的增殖活力随着Ca2+的增加而升高，当Ca2+达1.5mmol/L时，细胞的增殖活力有所下降，但与中钙组比较无显著性差异，显示在该浓度范围细胞增殖活性达最高值并处于稳定状态。但当Ca2+达到2.0mmol/L时，细胞的增殖活力迅速下降，低于对照组，两者之间具有显著差异，提示在该浓度下，细胞可能因高钙负荷而出现细胞死亡或凋亡，从而显示出一定的细胞毒性作用。
3.3 本研究采用表皮干细胞特异的表面抗原K19[4]为标志，研究Ca2+对HKC分化的影响，该表面抗原在低分化细胞呈强阳性表达，而在分化细胞表达弱或不表达。本研究发现，当Ca2+在0～0.5mmol/L范围时，K19表达为强阳性或阳性，提示在该浓度条件下大多HKC仍处于未分化状态。而当Ca2+在1.0～1.5mmol/L范围时，大多HKC已进入终末分化状态。本研究还发现当Ca2+达2.0mmol/L时，大部分HKC处于低分化状态，可能是由于细胞凋亡或死亡，而使其处于假性的“未分化”的状态。
3.4 如何在获得足够数量种子细胞的同时保持一定比例的表皮干细胞，是组织工程皮肤构建过程中十分重要的问题[5]，虽然近几十年以来，国内外一些实验室已经能够大量的进行HKC的体外扩增，但HKC在培养过程中易于老化，是亟待解决的问题。本研究显示，当Ca2+为0.5mmol/L时，HKC具有较强的增殖能力，并可保持大量细胞的处于未分化的干细胞状态，而在1.0～1.5mmol/L条件下，虽然HKC增殖能力较强但干细胞的比例却明显下降，在无Ca2+条件下，虽然细胞大多处于未分化状态，但HKC增殖停滞。该结果提示，Ca2+为0.5mmol/L时是维持种子细胞HKC扩增较理想的条件。
3.5 HKC分层是表皮屏障功能形成的重要环节，而HKC的分层与其正常的分化密切相关。在体外条件下，通过液气面培养[6]和改变Ca2+浓度可诱导HKC出现分层，本实验显示，当钙离子浓度大于1.0mmol/L时就可诱导HKC的分层现象，表明提高培养基中Ca2+是诱导HKC体外分层的又一途径。研究表明[7]，HKC分层与KC间桥粒的形成及粘附分子E-cadherin在HKC胞膜处的表达密切相关，已有资料显示[8]，Ca2+能够促进HKC间桥粒的形成，并增加E-cadherin在HKC表面的表达，因此，本实验中Ca2+诱导HKC的分层作用可能与Ca2+的此项功能有关。
3.6 在全层组织工程皮肤的使用过程中，常发生组织工程皮肤表皮或创面残余的表皮层脱落的现象，这一方面与创面营养不良有关，另一方面，创面局部特殊的离子环境也可能参与其中，创面局部酸性条件引起的高Ca2+环境可能诱导HKC迅速老化，从而导致表皮干细胞的数量减少，使皮肤移植失败或创面迁延不愈，本研究发现SK&F 96365能够逆转Ca2+诱导产生的细胞增殖与分化作用，提示钙通道阻滞剂的应用可能有助于该问题的解决。另外有研究显示，电压依赖性钙通道阻滞剂不能抑制Ca2+对HKC的调节作用[9]，而SK&F 96365[10-11]是一种非特异的对受体依赖性和电压依赖性的钙通道都具有阻滞作用的Ca2+通道阻滞剂，这说明Ca2+对HKC调控作用可能是通过受体依赖性钙通道发挥作用的，其确切机制还有待进一步探讨。
3.7 本试验结果提示，含0.5mmol/L Ca2+的H-KGM培养基是进行HKC扩增较为理想的培养条件，而1.0～1.5mmol/L Ca2+条件是促进复层表皮形成的重要条件，此发现对于组织工程人工皮肤的研制与开发具有重要意义，另外本研究还发现，钙通道阻滞剂SK&F 96365能够抑制上述的Ca2+引起的HKC增殖与分化的调控作用，其机制和意义还有待进一步探讨。
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[收稿日期]2007-06-05 [修回日期]2007-08-29
编辑/张惠娟
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”