髓系细胞中 C9orf72 抑制 STING 诱导的炎症 导读
肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)在临床表现、病理和遗传有很多共同点，并且这两种疾病种也都伴随着自身免疫性紊乱。C9orf72 基因突变导致蛋白表达降低，大脑和外周血细胞重复突变的 RNA 和双肽增加累积。本研究完全敲除了小鼠髓系细胞中的 C9orf72，进而发现小鼠表现出年龄依赖性淋巴细胞肥大和自身炎症，从 C9orf72−/− 小鼠中分离出来的树突状细胞显示 I 型干扰素反应早期激活，而 C9orf72−/− 髓系细胞对干扰素基因(STING)蛋白刺激因子过度激活，同时自身溶酶体途径对 STING 的降解减弱，激活了 C9orf72−/− 免疫细胞中的 I 型干扰素反应，造成了脾肿大和炎症。此外，还发现缺少一个或两个 C9orf72 基因拷贝的小鼠更容易患自身免疫性脑炎，这与 C9-ALS/FTD 患者对自身免疫性病的易感性相似，通过 STING 抑制剂可以降低 I 型干扰素。结果表明，C9-ALS/FTD 患者由于 C9orf72 蛋白水平降低无法抑制由 STING 介导的 I 型干扰素炎症反应最终导致免疫失调。
实验设计
结果
1 1
2 C9orf72 敲除小鼠免疫状态改变
C9orf72 敲除小鼠表现出淋巴器官增生和年龄相关性全身炎症。研究者发现 C9orf72−/− 小鼠在 8 周时出现有轻微炎症和淋巴样增生，在 8 个月时出现明显的全身炎症。DC 亚型在 C9orf72−/− 小鼠中发育正常，随着年龄的增长 CD11b DC 细胞上共刺激分子 CD86 的表达增加（图 1. a, b）。C9orf72−/− 小鼠胸腺中的 T 细胞发育正常，但是记忆和效应记忆 CD4 和 CD8 T 细胞的数量甚至在8 周时就增加了，并且随着年龄的增长变得更加明显(图 1.c, d)。
考虑到 C9orf72 在淋巴细胞中表达水平较低， 研究者将 C9orf72fl/fl 小鼠分别与 Cx3cr1 Cre和 LysMCre 小鼠进行杂交，以确定其髓系细胞的特有表型。C9orf72 fl/fl 小鼠体内中髓系群体(包括
单核细胞、组织巨噬细胞和 DCs13) C9orf72 缺失；Cx3cr1Cre 小鼠完全再现了脾肿大、DCs 中共刺激分子表达的改变以及 C9orf72 完全敲除小鼠中可见的 T 细胞激活（图 1.e），同样的现象也可以在 C9orf72fl/fl ；LyzM Cre 小鼠中观察到，同时可能因为 LyzM Cre 在 DC 中表达的较少(小于 10%)，而 Cx3cr1Cre 表达超过 90%，因此 LyzM Cre 表现程度较轻。为了进一步探索适应性免疫细胞的非细胞自主表型，研究对对照、C9orf72−/− 和 C9orf72 fl/fl ;Cx3cr1 Cre 小鼠的脾细胞群进行了分类测序。对 C9orf72fl/fl ；Cx3cr1 Cre 小鼠的 CD4 和 CD8 T 细胞的通路分析显示 I 型干扰素信号的选择性上调，表明 CD4 和 CD8 T 细胞受到髓系细胞产生的 I 型干扰素反应的刺激（图 1.g-i）。
图 1. 幼龄和高龄 C9orf72−/− 小鼠 DC 发育和 T 细胞激活。a, b ：CD86 在幼龄和高龄 CD11c+脾 DCs 中的平均荧光强度(MFI) (a;n = 5, b;n = 6)；c,d：8 周龄 CD8 T 细胞(c;n = 5)和 8 个月大 (d;n = 6)小鼠原始(CD62L+)、记忆(CD62L+CD44+)和效应记忆 CD4 T 和 CD8 T 细胞的流式细胞分析；e：左，C9orf72-Cx3cr1Cre 小鼠 5 个月时脾肿大的大体图像。右，脾脏重量； f：C9orf72-Cx3cr1Cre 小鼠幼稚 CD4 和 CD8 T 细胞数量减少，CD4 记忆 T细胞和 CD8 效应记忆 T 细胞数量增加(n = 7)；
g：GSEA 检测 C9orf72-Cx3cr1Cre 小鼠 CD8 T 细胞和 CD4 T 细胞中显著上调的信号通路 (错误发现率(FDR)小于 0.05)(n = 4)；h, i：
RNA-seq 的转录量(TPM)值，显示 CD8(野生型，n = 4;C9−/− ，n = 3;Cx3CR1 Cre , n = 3)和 CD4 T 细胞(野生型，n = 4;C9 −/− ，n = 3;Cx3CR1 Cre , n = 4)中ISGs 升高。
2
G STING 信号通过阻断自噬途径导致 I I 型干扰素反 应和炎症的持续激活
为了确定 C9orf72 缺失的 DCs 激活适应性免疫细胞的因素，研究者对野生型和 C9orf72−/−小鼠的脾 classical DCs 进行了 RNA 测序(RNA-seq)。
主成分分析(PCA)显示两种基因型分布不同，多种炎症细胞因子在 C9orf72−/− DCs 中高表达，包括白介素 IL-6，IL-10、IL-12β。用分层聚类进行的热图分析证实，四只小鼠中有三只的 C9orf72−/−
DCs 中的典型 I 型干扰素应答基因显著上调，而 NF-κB 信号无显著差异（图 2.a, b）。
为了确定 I 型干扰素反应过度活跃的潜在驱动因素，研究者使用几种激动剂 toll 样受体(TLRs)和胞质受体刺激野生型和 C9orf72−/− 骨髓源性巨噬细胞(BMDMs)。TLR3、TLR4 和 TLR7 信号触发了干扰素 IFN-β的产生。然而与野生型 BMDMs 相比，在 C9orf72−/− BMDMs 中使用 cGAS -STING 通路的激动剂可 IFNβ和干扰素刺激基因(ISGs)表达更加过度活跃(图 2.c-e)。
STING 信号通过溶酶体阻断自噬导致 I 型干扰素反应和炎症的持续激活，鉴于 C9orf72 参与核内体运输、自噬和溶酶体功能。研究者假设：C9orf72−/− 细胞中 STING 降解被抑制，进而观察到 C9orf72-/- BMDMs 受到 cGAMP 刺激后，STING 的降解延迟，并且 STING 在 365 丝氨酸上的磷酸化持续存在(图 2.f, g)，这表明 STING 通过干扰素调节因子 3 (IRF3)促进干扰素持续激活。在 C9orf72-/- BMDMs 中 LC3-II 的基础水平与对照组相比表达量明显增加，并且在 C9orf72 −/− BMDMs 中观察到 cGAMP 激活 STING 进而诱导 LC3-II 脂化进一步增加(图 2. h)。这一差异通过自噬抑制剂巴菲霉素 A1 的处理得以正常化，表明其部分原因是 C9orf72 缺陷细胞中 LC3-II 溶酶体降解降低所致(图 2.h)。这些数据建立了一个模型，在该模型中，通过自噬减少溶酶体对STING 的降解导致晚期核内体中 STING 水平的增加，这可以作为持续干扰素诱导的平台。支持这一观点的是，cGAMP 诱导 C9orf72 BMDMs 过度活跃的 IFN 可以被 STING 拮抗剂完全阻断(图2.i)。为了进一步确定 C9orf72−/− 小鼠 I 型干扰素信号升高是由 STING 在体内驱动的，研究者对 C9orf72−/− 小鼠和 STING gt/gt 小鼠进行交配，比较发现比起 STING gt/gt
小鼠，C9orf72 −/− 小鼠脾肿大和髓细胞激活状态都得到了缓解(图 2.j, k)。为了进一步描述 C9orf72−/− 小鼠脾肿大和髓细胞激活状态得到缓解的特征，随后研究者对野生型、 C9orf72−/− 和 C9orf72 −/− 、STING gt/gt 小鼠的脾脏细胞进行 RNA-seq，分离的脾脏 CD11b 髓细胞、B 细胞、CD4 和 CD8 T 细胞中 I 型干扰素升高反应被 STING 的降低完全解除（图 2. l）。C9orf72−/− 、STING gt/gt 小鼠全身炎症表型并没有完全解除可能是由于 STING 缺失本身促进 TLR 信号过活跃和炎症反应，或者是因为 C9orf72 也可以调节与非 STING 相关的通路。无论如何，这些发现支持了在 C9orf72−/− 骨髓细胞增加 STING活动促进了 I 型干扰素缓慢升高，这是 C9orf72−/− 小鼠系统性自身炎症的关键部分。
图 2. 髓系细胞中 C9orf72 的丢失通过 STING 导致 I 型干扰素的增加。a, b：干扰素相关基因和 NF-kB 相关基因表达热图；c-e, qRT-PCR 分析野生型和 C9−/− 小鼠受到 cGAMP 刺激后 BMDMs 中的 Ifnb1 (c)、Mx1 (d)和 Cxcl10 (e)的表达情况；f：对 cGAMP 刺激 0、6、9、24、小时或 bafilomycin (Baf)刺激 24 小时的 BMDMs 进行 Western blot 分析，结果显示与野生型细胞相比，C9−/− 的 STING 降解延迟；g：左，STING 磷酸化 (pSTING，丝氨酸 365磷酸化)的 western blot 分析，右，从 n = 3 个生物重复实验中量化 pSTING；h：cGAMP 刺激 BMDMs 0、6、24、24 小时或者在 bafilomycin 作用 24 小时的 Western blot 分析显示 LC3-II 表达.；i：使用 cGAMP 刺激 6 小时后，qRT-PCR 分析野生型和 C9−/−
BMDMs 中 Ifnb1 的表达情况；j 左侧，8-10 周(n = 7)时脾脏重量(毫克)标准化为体重(克)；右侧，粗略的代表性图像；k：
qRT-PCR 分析野生型(n = 6)、STING 缺失（Gt−/− ；n=3）, C9−/− (n = 5)和 C9 −/− ：Gt −/− (n = 6)小鼠的脾细胞中的 Trem2 和 IL10；L：3 月龄野生型(n = 4), C9 −/− (n = 3)和 C9 −/− /Gt −/− (n = 4)小鼠脾脏 CD11b 细胞 ISG 表达的 RNA-seq 分析。
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C9orf72− −/ /− − 小鼠免疫表型改变导致自身免疫性疾病的易感性增强、抗肿瘤免疫增强
观察到 IL-12β在 C9orf72−/− DCs 中的高表达，其与 IFNα/β相结合，可以促进 T 细胞向 TH1表型分化，为了支持这一点，研究者发现 IL-2 和 IFN 的表达在受刺激的 C9orf72−/− 小鼠脾中增加并且表现出 TH1 表型的标记。IL-17 的表达也呈显著升高趋势，IL-17 的表达促进了 TH17 细胞的生成，进一步说明 C9orf72−/− 小鼠的慢性 STING/ I 型干扰素激活对适应性免疫细胞的刺激导致了自身免疫性疾病的倾向。
因此，研究者分析了 C9orf72−/− 小鼠是否更容易患自身免疫性脑炎（EAE）。观察到，在缺乏 C9orf72 一个或两个拷贝的小鼠中，临床严重程度和脊髓炎症呈分级的基因剂量依赖性增加（图 3. a, b）。杂合子小鼠对 EAE 敏感性的增加有重要意义，因为 C9orf72 的表达只在重复
扩张载体组织中部分丢失，因此环境应激源的刺激是必要的。这支持了 STING 在 DC 中慢性活化促进 TH1 偏向 T 细胞表型分化，TH1 偏向 T 细胞在 EAE 过程中浸润神经系统，导致炎症反应增强。值得注意的是，髓系细胞慢性激活 STING 和 C9orf72−/− 小鼠中适应性免疫细胞的激活不同于 EAE 中急性激活 STING，后者通过直接促进 T 细胞调节反应和抑制 TH1 反应来减轻严重程度。
有趣的是，研究也表明 ALS 患者中各种癌症的发生频率发生了改变。DCs 在维持免疫系统的稳定中起着核心作用，自身免疫的倾向也与增强的抗肿瘤免疫能力有关. 因此，研究者检查了抗肿瘤免疫模型 C9orf72−/− 小鼠，测量静脉注射小鼠 B16 黑色素瘤细胞后的肿瘤负荷。观察到 C9orf72 在肺中的 B16 黑色素瘤肿瘤负荷中呈剂量依赖下降，缺少一个或两个 C9orf72 拷贝的小鼠比野生型小鼠更耐受肿瘤(Fig. 3c–e)，这一反应伴随着 B16 接种后肺和脾脏中活化T 细胞数量的增加。这些数据与之前的研究一致，表明 STING 是介导启动抗肿瘤 CD8 效应 T 细胞的关键。类似地， STING 型干扰素对 C9orf72−/− DCs 肿瘤来源 DNA 的反应更有效地驱动细胞毒性抗肿瘤 T 细胞。总之，这些发现表明，在 C9orf72−/− 小鼠中观察到的免疫表型改变(或在C9orf72 丢失一个副本之后)导致自身免疫性疾病的易感性增强和抗肿瘤免疫增强。
图 3. C9orf72−/− 小鼠对 EAE 更敏感，与野生型小鼠相比，抗肿瘤免疫能力增强。a,b：
野生型(n = 13)， C9 +/− (n = 13)和 C9 −/− (n = 10)小鼠 EAE 过程中的临床评分(a)和体重(b)；c：野生型、C9 +/− 和 C9 −/− 小鼠接种 B16 黑色素瘤 14 天后的代表性肺图像；d, e：
C9−/− 小鼠的肿瘤集落数量减少(d;野生型，n = 8; C9 +/− ，n = 8;C9 −/− ，n = 9)，接种 B16 黑色素瘤细胞 14 天后黑色素含量降低 (e;野生型，n = 6;C9+/− ，n = 8;C9 −/− ，n = 9)。
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C9- -D ALS/FTD 患者具有 I I 型干扰素信号过度活跃的免疫失调表型
研究者使用 RNA-seq 检测了正常对照组、散发性 ALS 患者和 C9-ALS 患者的血液单核细胞来源巨噬细胞(MDMs)，评估 C9orf72 重复扩增的髓系细胞中是否存在类似的免疫表型改变。基因集富集分析(GSEA)显示，C9-ALS MDMs 与散发性相比， IFNα/β信号通路相关的通路显著上调，与 C9orf72−/− 小鼠免疫细胞中发现的上调通路几乎相同（图 4.a-c；图 1.g）。此外，研究者通过外部验证集证实了先前报道的 C9orf72 在 C9-ALS 携带者中的低表达(图 4. d)，观察到 C9-ALS 患者相较于散发性 ALS 患者 I 型干扰素信号显著上调(图 4. e)。
为了评估这种基因型驱动的炎症特征是否存在于神经组织中，研究者分析了之前发表的ALS 患者 RNA-seq 数据集。再次观察到 C9-ALS 患者相较于散发性 ALS 患者小脑 C9orf72 表达水平降低和 I 型干扰素反应上调(图 4. f)。为了确定 I 型干扰素信号是否来自小胶质细胞，研究者检测了 cGAMP 刺激后分离的小胶质细胞产生的 IFNβ，观察到 STING 激活状态类似于C9orf72−/− 小鼠外周血巨噬细胞(图 4.g)。最后，为了确定在 C9-ALS 骨髓细胞中观察到的 I 型干扰素信号升高是否由 STING驱动，用 STING抑制剂处理了患者外周血单核细胞(PBMCs)或 MDMs,观察到 STING抑制剂 H151没有改变散发性 ALS患者外周血细胞中 ISG的基本表达，但在 C9-ALS中持续抑制 ISG 的表达(图 4.h)。通过对 C9-ALS 患者的经 H151 治疗的 MDMs 进行 RNA 序列分析，观察到 ISGs 的广泛抑制(图 4. i)。这些发现有力地支持了 C9-ALS/FTD 患者具有基因决定的免疫表型的观点，其特征是 I 型干扰素信号过度活跃，其中部分是由 STING 激活驱动的。
图 4.肌萎缩性侧索硬化症中 C9orf72 重复扩增患者外周血髓细胞中 I 型干扰素信号增强，可被 STING 拮抗剂抑制。
a：C9-ALS 患者(n = 5)和散发性 ALS 患者(n = 5) MDMs 的 GSEA (FDR 小于 0.05)；b：C9-ALS,散发性肌萎缩侧索硬化症和正常对照组(n = 5)MDMs 中 I 型干扰素刺激基因表达值；c, b：中干扰素刺激基因的 qRT-PCR验证(n = 3)；d：遗传 C9-ALS 患者的 RNA-seq (n = 20)显示 C9orf72 表达低于散发性 ALS 患者(n = 259)； e：C9-ALS 患者与散发性 ALS 患者全血 RNA-seq 中上调的通路：f：C9-ALS 患者(8 例)与散发性 ALS 患者(10 例)小脑组织炎症通路上调；g：qRT-PCR 分析野生型(n = 4)和 C9−/− (n = 4)小鼠大脑中分离的小胶质细胞在 cGAMP刺激后产生 IFNβ蛋白； h：对散发性 ALS 和 C9-ALS 患者有无 STING 抑制剂 H151 治疗的 PBMCs 中 MX1 和 STAT1的 ISG mRNA 进行 qRT-PCR 分析；i：H151 治疗和未治疗的两名 C9orf72 患者的 MDMs 的 RNA-seq 显示干扰素刺激基因表达值，蓝色表示百分比下降;红色表示百分比增加。
结论
总之，骨髓细胞(包括 DCs)中的 C9orf72 对维持免疫稳态至关重要，C9orf72 的缺失会促进 I 型干扰素的过度活跃产生、适应性免疫激活、增强自身免疫和抗肿瘤免疫。C9orf72−/− DCs 中的 I 型干扰素反应可通过阻断 STING 得到缓解。值得注意的是，DC 特异性敲除 TBK1 会产生类似的免疫表型，小鼠会出现全身干扰素驱动的炎症、自身免疫性疾病和癌症抗性增加，支持 ALS/FTD 中 C9orf72 和 TBK1 信
号通路重合。然而，在 TBK1 缺乏的 DCs 中 I 型干扰素信号升高的矛盾性质表明，TBK1 并不仅仅作为STING 的下游效应因子。本研究的一个重要发现是 C9-ALS 患者的骨髓细胞、全血和脑组织中存在增加的 I 型干扰素可以作为 C9orf72 功能的潜在生物标志物。可以进一步推测 C9orf72 在 C9-ALS/FTD患者中的表达降低促进了干扰素的产生，改变了他们对环境因素(如创伤或感染)的反应，并可能影响ALS、FTD 和自身免疫的后续发展。