[摘要]目的探讨一种改善肺组织切片质量的方法。方法取家兔子的肺部,用Bouin氏液进行固定;再进行脱水、透明、石蜡包埋、切片和HE染色,最后在光镜下观察结果。结果肺组织结构和层次均基本保持完整,细胞形态清晰。结论肺组织用Bouin氏液固定液固后脱水法制作石蜡切片方法是可行的。
[关键词] 肺组织;脱水;透明;石蜡包埋;显微切片术
[中图分类号]R563[文献标识码] B [文章编号]
肺组织分实质和间质两部分,间质包括结缔组织及血管、淋巴管、神经等。实质即肺内支气管的各级分支及其终末的大量肺泡。由于肺组织内含有大量空气,脱水、浸蜡是往往达不到最佳效果,故在制作石蜡切片时较一般组织困难。通常使用传统的明胶包埋法,不但费时间,且成本高,同时切片较厚影响观察,不能适应实际需要。我们反复实践认为需注意以下方法较好。
1材料和方法
1.1材料
1.5公斤家兔,耳背外侧的静脉(耳缘静脉)注射20-60ml空气,使其心脏在短暂时间内发生急性空气栓塞,造成机体血液循环障碍痉挛死亡。取肺叶下1/3处。
1.2固定
Bouin氏液固定液配方:苦味酸饱和水溶液75mL+10%中性甲醛10 mL+冰醋酸(分析纯)5mL,将上述3种溶液混匀后备用。肺内含有许多空气往往会阻碍固定液的渗透,因此我们采取灌注法固定。将肺部取出,用注射器将空气抽出,注意此时不可抽气过度使肺泡塌陷,用细线结扎气管一端均匀注入少量固定液到肺叶内部,使肺叶完全扩张,切忌过度膨胀,注射完毕后将肺放入固定液固定6-7小时候后,切成直径0.4cm左右组织块,放入密闭广口玻璃瓶,瓶内放入2-3个棉球继续固定5-6天,(组织已完全下沉,说明液体已全渗透组织中)。在此期间需要轻轻摇动玻璃瓶有利于固定液对组织的渗入和防止组织与玻璃瓶粘连。
[注意]瓶内放棉球可以避免组织与瓶壁粘连。
1.3 冲洗
将固定好的肺部放入盛有200ml低浓度60%乙醇中浸泡60分钟后,更换70%乙醇,以后每隔12小时换一次新的70%乙醇,浸泡洗涤的时间为24小时。乙醇浸洗的同时兼有脱水的作用,也可洗脱Bouin固定液的黄色。
1.4室温脱水与透明
脱水(常温下)
(1)80%乙醇24h
(2)90%乙醇4h
(3)95%乙醇Ⅰ 120min
(4)95%乙醇Ⅱ 120min
(5)无水乙醇Ⅰ60min
(6)无水乙醇Ⅱ60min
(7)无水乙醇Ⅲ60min
[注意]①未经充分固定的组织不得进入脱水程序。②用于脱水的试剂容积应为组织块总体积的5～10倍以上。③自低浓度乙醇向高浓度乙醇逐级移进脱水。④脱水试剂应及时过滤、更换。⑤组织置于无水乙醇内的时间不宜过长(以免硬脆)。
透明
(1)加二甲苯的100%乙醇(按1∶1混合)15min
(2)二甲苯Ⅰ20min
(3)二甲苯Ⅱ20min
[注意]①组织块在二甲苯中透明的时间不宜过长(以防组织硬、脆)不同种,组织呈现棕黄或暗红色透明即可。②二甲苯应及时过滤、更换。③组织经二甲苯适度处理后不显透明时,常提示该组织的固定或脱水不充分,应查找原因并妥善处理。
1.5浸蜡与包埋
透明后的组织在加二甲苯的软蜡(按1:1混合,56～58℃)中浸30min→蜡Ⅰ(56～58℃)浸1h→蜡Ⅱ(58～60℃)浸1h,继而用石蜡(56～58℃)包埋。蜡块冷却后即可修整、切片,亦可保存于4℃冰箱内。
[注意]①组织块经二甲苯适度透明后方可转入浸蜡过程,应尽可能减少将透明后组织块表面的二甲苯带入熔蜡中。②浸蜡时间适宜,过短时浸蜡不充分(组织过软),过长时组织硬脆。③熔蜡应及时过滤、更换。④包埋过程要操作迅速,以免组织块尚未埋妥前熔蜡凝固。⑤包埋用的镊子不可加温过高,以免烫伤组织。
1.6切片与染色
蜡块于水平位连续切片,厚度为4～6μm,在水温37～40℃展片,然后将切片置56～60℃烤箱内烤12～24h后行常规脱蜡、水合和HE染色(苏木精浸染10 min→水洗去浮色→1%盐酸乙醇分色→1%氨水蓝化→自来水流水冲洗30 min→70%乙醇2 min→80%乙醇2 min→浸染伊红乙醇5 min→95 %乙醇分色)。然后再常规脱水、透明、中性树胶封固,最后用光镜观察。
[注意]①切片刀或一次性切片刀片必须锋利。②切片时轮盘转动要均匀,尤其是切片刀刀刃经过蜡块时,可以避免切片呈现横向的“波纹”。 ③取蜡带时不要遇到水,避免受潮粘在纸上不能使用。④展片时水温过高会产生许多大小不等的气泡,建议用蒸馏水。⑤切好的片子要及时放入烤箱内,在室温下长时间放置使水分挥发,灰尘落在切片上使片子变白染色时易照成脱片现象。⑥为保持树胶为中性和切片不易退色,通常在树胶瓶内加入适量的大理石碎石。
2结果
肺组织的结构和层次均基本保持完整,细胞形态清晰。
3讨论
由于肺组织内含有大量空气,通过抽空气直接灌注法固定,固定时间较长细胞不易变形,有利于组织充分脱水。二甲苯作为透明剂的效果比较强烈和快速,应掌握好透明的时间,既要完全透明,又不可过度,一般约30～40min为宜。通过上述的方法,我们在实际操作中,取得了满意的效果。
参考文献
[1]方志明,尹洪萍,袁红. 肺组织石蜡切片技术的改良《杭州师范学院学报》(自然科学版)[J].2005, 4( 6).
[2] 赵荧,唐军民《形态学实验技术》第2章