实验七 凝胶渗透色谱法测定聚合物的相对分子质量及其分布 一、实验目的 1.了解凝胶渗透色谱法测定聚合物相对分子质量及其分布的原理。
2.了解凝胶渗透色谱仪的仪器构造和初步掌握凝胶渗透色谱仪的实验技术。
3．测定聚苯乙烯样品的相对分子质量及其分布。
二、实验原理 聚合物的相对分子质量量及其分布是聚合物性能的重要参数之一，它对聚合物材料的物理机械性能和可加工性等影响很大。测定聚合物的相对分子质量及其分布的最常用、快速和有效的方法是凝胶渗透色谱法（gel permeation chromatography，简称GPC）。
1. GPC分离机理 GPC是一种新型液相色谱，除了能用于测定聚合物的相对分子质量及其分布外，还广泛用于研究聚合物的支化度、共聚物的组成分布及高分子材料中微量添加剂的分析等方面。同各种类型的色谱一样，GPC具有分离功能，其分离机理比较复杂，目前还未取得一致的意见。但在GPC的一般实验条件下，体积排除分离机理被认为起主要作用。
体积排除分离机理的理论认为：GPC的分离主要是由于大小不同的溶质分子在多孔性填料中可以渗透的空间体积不同而形成的。装填在色谱柱中的多孔性填料（凝胶）的表面和内部分布着大小不同的孔洞和通道。当被测试的多分散性试样随淋洗溶剂进入色谱柱后，溶质分子即向填料内部孔洞渗透，渗透的程度取决于溶质分子体积的大小。体积较大的分子只能进入较大的孔洞，而体积较小的分子除了能进入较大的孔洞外还能进入较小的孔洞，因此体积不同的分子在流过色谱柱时实际经过的路程是不同的，分子体积越大，路程越短。随着溶剂淋洗过程的进行，体积最大的分子最先被淋洗出来，依次流出的是尺寸较小的分子，最小的分子最后被淋洗出来，从而达到使不同大小的分子得到分离的目的。以上为GPC机理的一般解释。
按照一般的色谱理论，试样分子的保留体积VR（或淋出体积Ve）可用下式表示：
Ve=Vo+KVi 式中，Ve为淋出体积，即指溶液试样从进色谱柱到被淋洗出来的淋出液总体积；
Vo为柱中填料粒子的粒间体积；
Vi为柱中填料粒子内部的孔洞体积；
K为分配系数，即可以被溶质分子进入的粒子孔体积与粒子的总孔体积之比。
对于比最大孔洞还要大的分子，K＝0，Ve=Vo首先被洗提出来，色谱柱对于这类分子没有分离作用；
对于能进入填料所有孔的最小分子，K=1，Ve=Vo+Vi，最后被洗提出来，色谱柱对于这类分子也没有分离作用；
对于尺寸介于上述两极端之间的分子，0<K<1，Ve=Vo+KVi，大小不同的分子有不同的K值，相应的保留体积也就不同，从而这些分子将按照分子体积由大到小的次序被洗提出来。
由于聚合物分子在溶液中的体积决定于其相对分子质量、分子链的柔顺性、支化程度、溶剂和温度。若聚合物分子链的结构、溶剂和温度确定后，聚合物分子的体积主要依赖于其相对分子质量。因此，当多分散聚合物分子随着溶剂流经GPC色谱柱时，这些分子将按照分子体积由大到小的次序被分离出来，实际上对应着相对分子质量由大到小次序的分离。
2. GPC谱图的标定及校正曲线 聚合物试样被凝胶色谱柱按相对分子质量大小分级后，需要对各级分的含量和相对分子质量进行测定和标定才能得到相对分子质量的分布情况。在GPC技术中，淋出液的浓度直接反映级分的含量，只需采用示差折光、紫外吸收或红外吸收等检测器检测淋出液浓度，就可测出各级分的含量。常用示差折光仪测得溶液折光指数与纯溶剂折光指数之差Δn，由于在稀溶液范围，Δn正比于溶液浓度c，因此Δn值直接反映了淋出液的浓度，即反映了各级分的含量。相对分子质量的测定有直接法和间接法。直接法是将淋出体积不同的各级分用相对分子质量检测器(如自动黏度计或小角激光光散射检测器)在浓度检测器测定溶液浓度的同时，测定其黏度或光散射，从而计算出相对分子质量及其分布的数据，计算中不需要校正曲线。间接法又称校正曲线法，是根据校正曲线，将测出的淋出体积换算成相对分子质量的方法。本实验采用间接法测定聚合物的相对分子质量。
GPC仪由输液系统（柱塞泵）、进样器、色谱柱、检测器及一些附属电子仪器组成。图7-1是GPC的构造示意图，淋洗液通过柱塞泵成为流速恒定的流动相，进入紧密装填多孔性微球的色谱柱，中间经过一个可将样品送往体系的进样装置。聚合物样品进样后，淋洗液带动溶液样品进入色谱柱并开始分离，随着淋洗液的不断洗提，被分离的聚合物组分陆续从色谱柱中淋出。浓度检测器不断检测淋洗液中聚合物组分的浓度响应，数据被记录得到一条GPC 淋洗曲线（图7-2）。如图7-2所示，纵坐标为洗提液与纯溶剂折光指数的差值Δn，在极稀溶液中它正比于洗提液的相对浓度c；
横坐标为保留体积Ve它表征分子尺寸的大小，与相对分子质量M有关，将GPC色谱图中横坐标保留体积换算成相对分子质量，需要借助于“校正曲线”。
GPC标定（校正）曲线表示的是Ve与M关系的曲线。在相同的测试条件下测定一组已知相对分子质量M的窄分布标准样品的GPC谱图（图7-3），求各峰值位置的保留体积Ve，以lgM对相应的Ve作图即可得到GPC校正曲线（图7-4）。从其直线部分得到校正方程：
lgM=A-BVe 3. GPC数据处理方法 GPC的数据处理一般采用“切割法”。在谱图确定基线后，将基线和淋洗曲线所包围的面积以横坐标进行等距离切割，分割成一组平行于纵坐标的宽度相等的长条（图7-5），相当于把样品分成一系列级分，且每个级分的溶液体积相等。对于第i个长条的保留体积为Vi，由校正曲线确定其相对分子质量Mi， 而级分的浓度对应于检测器在Vi处的响应即长条的高度Hi，则每个切割条的归一化高度(高度分数)即为各级分的含量。又因Hi正比于级分i的质量wi因此相对分子质量为Mi的第i级分的质量分数可表示为 WiMi=HiiHi 以所有切割条的归一化高度和相应的相对分子质量列表或作图，可以得到完整的聚合物样品的相对分子质量分布结果。计算中，运用了“每一分割条内的聚合物的相对分子质量是均一的”假定，故所取间隔越小，计算中取的点越多，假定与实际的偏差就越小。换言之，切割条数的增多有利于计算结果精度的提高，但一般切割条数达到20条以上即可，此时对相对分子质量分布描述的误差已经小于GPC方法本身的误差。
根据各种平均相对分子质量的定义，由以下各式可计算出各种平均相对分子质量和多分散系数（polydispersity index，PDI）：
Mw=iWiMi=iMiHiiHi=iHiMiiHi Mn=iWiMi-1=[i1MiHiiHi]-1=iHiiHiMi Mη=iMiαHiiHi1α PDI=MwMn 三、仪器与试剂 1. 仪器 PL-GPC50，PL-AS RT型自动进样器，电子天平，微孔滤膜，微孔过滤器，样品瓶，注射器等。
2. 试剂 氯仿，聚苯乙烯标准样品，相对分子质量未知的聚苯乙烯样品。
四、实验步骤 1. 溶剂准备 所用溶剂（氯仿）需经过蒸馏、微孔滤膜过滤，使用前还需脱气，方可倒入溶剂贮存瓶使用。
2. 样品准备 （1）选取10个不同相对分子质量窄分布的聚苯乙烯标样，分为三组，每组标样分别称取一定量混在一个样品瓶中，注入一定量的溶剂（氯仿），溶解后用装有微孔滤膜的过滤器过滤，转移至样品瓶中待用。
（2）称取一定量相对分子质量未知的聚苯乙烯样品于样品瓶中，加入溶剂（氯仿），通常为每3-8 mg样品溶解在1.5 mL溶剂中，溶解后用装有微孔滤膜的过滤器过滤，转移至样品瓶中待用。
3.仪器开机 （1）开机。打开GPC主机电源和自动进样器电源，仪器自检，等待完成。
（2）GPC运行条件的设定。打开计算机，双击桌面“PL Inst Control”图标，连接GPC50-Control软件，进行仪器和计算机之间的连通，设定流速、炉温以及示差折光检测器的参数。一般测试流速设为1mL⋅min-1，炉温为40℃。（注意: 确认“Injection Valve”处于“Load”状态）。当运行流速达到1mL⋅min-1时，对检测器冲洗5次。点击自动进样器“Autosampler”图标，进入自动进样器操作界面。点击“Initialise Arm”图标，自动进样器会自动调整旋臂位置。点击“Solvent Flush”图标，自动进样针会自动移至冲洗池，然后自动进样泵会吸取1mL溶剂，通过六通阀、自动进样针至冲洗池，实现冲洗后通过废液排出口排出自动进样器，这个过程会自动重复多次。此时自动进样器显示状态为 “Ready”。
4．打开运行监视窗口 双击打开桌面的“Data Stream Monitor”图标，选择菜单栏中的“Channel”, “Add Channel”，此时弹出一个窗口,选中左栏的“GPC50 on COM4”，右栏会显示四行字符，选择第一行的“RI(1)”，点击“OK”，即可打开“Monitor”窗口。
5．采集文件的设定 （1）双击打开桌面“GPC Online”图标，设置测试样品序列及信息。选择文件名为“XXX”的工作簿（Workbook），点击“OK”打开。计算机提示“Collection Device ready to begin collection”，点击“OK”。点击左侧的“Views”栏中的“Collection Runlist”按钮，右侧会显示将要测试的样品序列（Sample No.）、样品批号(Batch Name)、样品名（Sample Name）、样品类型（Sample Type）、方法（Method）等7个项目。打开菜单栏中“Runlist” 的“Add sample”添加样品，也可以选择“Add multiple samples”一次添加多个样品。然后输入具体的“Batch Name”和“Sample Name”，选定合适的“Sample Type”和“Method”。
a．GPC标样的设定 在“GPC Online”左侧的“Method Browser”中建立新方法，输入方法文件名“YYY”，再按照前述步骤设定采集文件。对于三组标样，其“Sample Type” 均选择为“Narrow Standard”，“Method”均选择为“YYY”。
b．未知样品的设定 按照前述步骤设定采集文件。未知样品的“Sample Type”选择为“Unknown” “Method”选择为“None”或“YYY”。
（2）自动进样器控制面板示意图，按照“GPC Online”中设置的样品序列，双击面板中相应样品的位置，即可将其加入到右侧“Current Vial Sequence”中，同时该位置会变为绿色高亮，重复双击可取消选中。在“Current Vial Sequence”中可以设置样品的名称及进样次数（同一个样品可以多次进样），在生成的“Injection Sequence”中可以看到相应的进样顺序及次数，务必保证“Injection Sequence”中的测试样品序列与“GPC Online”中的设置相同。
6．进样测试 待仪器基线稳定后，对GPC标样和未知样品进行测试，具体步骤如下：点击 “Injection Sample(s)”图标，计算机提示“Collection Device ready to begin collection”，点击“OK”即可开始进样。进样时，自动进样器会抽取约0.5 mL的溶剂，进样完毕后，自动进样器会自动冲洗进样针，准备下次进样。进样时，控制面板中处于测试状态样品相应位置的颜色会由绿色高亮变为红色高亮。此时，“Data Stream”中的基线变为红色。当样品测试结束时，“Data Stream”监视窗口上应显示“No Injection”，基线为蓝色。
a．GPC标样的测定：自动进样器按照已设定顺序先后将三个混合标样溶液进样，运行，分别得到相应的GPC淋洗曲线（即GPC谱图）。
b．未知样品测定：用自动进样器将未知样品溶液进样，运行，得到其GPC谱图。
五．数据处理 1. 双击桌面的“GPC Offline”图标，打开名为“XXX”的工作簿（Workbook），点击“OK”。
2.选择左侧的“Analysis Runlist”，在右侧会按照“Batch Name”来显示已经测试过的样品文件，双击样品名将此样品加入到分析列表中。
3.双击列表中样品的“Method”项目，选择“YYY”方法后，按F9键（或弯箭头）。然后点击左侧的“Analysis”，调整峰的数目以及基线的位置。
4.最后单击右键，选择“Calculate Results”即可完成分析。
a．GPC标样分析 每一组标样按照上述步骤进行分析，得到一张包括峰顶淋洗体积Ve和M等多个项目的表格，对应于每一Ve值输入相应标样的Mp值，最后点击鼠标右键，选择“Add To Calibration”，将M与相应的Ve数据添加到“YYY”方法文中。从三个混合标样所对应的三张淋洗曲线可确定共10个标样的淋洗体积，又根据10个标样的已知的Mp值，即可作出lgM~Ve图，从而得到GPC校正曲线及校正方程，生成了“YYY”方法文件。
b．未知样品分析 确定未知样品溶液所对应的淋洗曲线的基线，利用上面由标样得到的GPC校正曲线，对未知样品各流出级分的相对分子质量和信号强度进行统计计算，即可得到其各种平均相对分子质量（Mn、Mw、Mη）和相对分子质量分布。
5.实验报告的生成 双击打开桌面的“GPC Offline”图标，依次点击“File”、“Produce Analysis Report”、“Sample Report”，选择输出方式（如Adobe PDF），选择报告模板（如Unknown Injection US-C），输入报告文件名。
思考题：
1. 简述凝胶渗透色谱的分离机理。
答：GPC是一种新型液相色谱，除了能用于测定聚合物的相对分子质量及其分布外，还广泛用于研究聚合物的支化度、共聚物的组成分布及高分子材料中微量添加剂的分析等方面。同各种类型的色谱一样，GPC具有分离功能，其分离机理比较复杂，目前还未取得一致的意见。但在GPC的一般实验条件下，体积排除分离机理被认为起主要作用。
体积排除分离机理的理论认为：GPC的分离主要是由于大小不同的溶质分子在多孔性填料中可以渗透的空间体积不同而形成的。装填在色谱柱中的多孔性填料（凝胶）的表面和内部分布着大小不同的孔洞和通道。当被测试的多分散性试样随淋洗溶剂进入色谱柱后，溶质分子即向填料内部孔洞渗透，渗透的程度取决于溶质分子体积的大小。体积较大的分子只能进入较大的孔洞，而体积较小的分子除了能进入较大的孔洞外还能进入较小的孔洞，因此体积不同的分子在流过色谱柱时实际经过的路程是不同的，分子体积越大，路程越短。随着溶剂淋洗过程的进行，体积最大的分子最先被淋洗出来，依次流出的是尺寸较小的分子，最小的分子最后被淋洗出来，从而达到使不同大小的分子得到分离的目的。以上为GPC机理的一般解释。
2. 为什么在凝胶渗透色谱实验中，样品溶液的浓度不必准确配制？ 答：因为一般GPC测试是用相对法计算结果，即利用出峰时间对应标准曲线来算得相对分子量，而GPC的分离原理是基于分子的体积大小，与溶液浓度无关，所以样品浓度不必准确配置；
但浓度也应该在一个合适的范围，浓度过大会导致峰展宽、拖峰等，过小则检测信号弱，信噪比较低，都会影响结果。
3. 相对分子质量相同的样品，线性分子和支化度大的分子何者先流出GPC色谱柱？ 答：一般是支化度大的分子比线形分子先流出色谱柱。
4. 试比较“校正曲线”与“普适校正曲线”在用法上的不同。
答：校正曲线主要用于对于同类型的聚合物分子，在窄分布标准样品进行标定。而普适校正曲线适用于在相同测试条件下不同结构、不同化学性质的聚合物试样。
对于各种不同的聚合物，其特性黏数[η]和相对分子质量M的乘积与淋出体积Ve的关系都落在同一条直线上，此[η]M代表溶液中聚合物分子的流体力学体积。以lg([η]M) 对VR作图，即得到普适校正曲线。
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