[摘要]目的：在浙江地区对瘢痕疙瘩p53 基因检测试剂盒进行临床实验, 评价此试剂盒的准确度和有效性。方法：采用聚合酶链反应-反向点杂交方法建立的试剂盒检测了浙江地区75例瘢痕疙瘩患者与75例正常对照的p53基因第72位密码子多态性位点的基因型。结果：瘢痕疙瘩组的Pro等位基因及Pro/Pro基因型频率明显高于对照组(P值分别为0.014、0.015)，Pro/Pro基因型者患瘢痕疙瘩的风险性明显增高(OR=2.404,95%CI:1.182～4.887)。结论：p53基因检测试剂盒可以预测瘢痕疙瘩高危个体，对于临床诊断和治疗方面也有一定的指导意义，并具有良好的可重复性和特异性。
[关键词]瘢痕疙瘩；p53基因；基因多态性检测；试剂盒
[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）05-03
The application of p53 gene detection kit for suscepbility of keloid
ZHUO Yang,GAO Jian-hua,ZENG Xing-ye,HUANG Da-dao,PAN Ruo-wang,CAO Xiao-en
(Department of Surgery,the 118th Hospital of PLA,Wenzhou 325000,Zhejiang,China)
Abstract： ObjectiveTo investigate the keloid testing box of p53 gene by clinic experiment and judge its validity and accuracy in Zhejiang Province,China.MethodsThe p53 genotypes were determined by polymerase chain reaction-reverse dot blot(PCR-RDB) that the kit adopt among 75 patients with keloid and 75 unrelated healthy controls from Zhejiang Province.ResultsThe frequency of the p53 Pro allele and the Pro/Pro genotype among keloid patients was significantly higher than that among healthy controls(P=0.014、0.015 respectively).The p53 Pro/Pro genotype significantly increased the risk for developing keloid,compared to the combination of Pro/Arg and Arg/Arg genotypes,with the odds ratio(OR) of 2.404(95%CI: 1.182～4.887).ConclusionThe p53 gene detection kit can be used to predicate high-risk individuals for keloid,it is useful to clinical diagnose and therapy effects monitoring.The keloid testing box is specific and valuable to repeated detection.
Key words：keloid;p53 gene;gene polymorphism detection;reagent kit
瘢痕疙瘩属于病理性瘢痕，是由于结缔组织对创伤的过度增生反应而形成。研究结果提示瘢痕疙瘩成纤维细胞的过量增生和凋亡相对减少在瘢痕疙瘩的发生发展中起着重要作用[1]。p53基因是重要的细胞周期调节、凋亡基因，在多种肿瘤细胞中均可发现p53蛋白的聚集现象,并与p53基因突变或缺失有关[2]。随着分子遗传学的进展，了解遗传因素在疾病中的作用将有利于疾病的诊断、治疗和预防,也有助于了解环境因素在疾病发生中的作用。我们的前期工作已发现p53基因第72密码子多态性与瘢痕疙瘩的发生存在关联关系，在此,我们在浙江地区应用此试剂盒对瘢痕疙瘩临床患者做相关检查, 检验其有效性, 为临床瘢痕疙瘩的预防和治疗提供可靠的途径。
1材料和方法
1.1 试剂盒组成（一个试剂盒可检测10份样品）
1.2需自备的仪器及试剂： PCR仪及分子杂交箱，2×SSC～0.1%SDS(20×SSC40ml,10%SDS 4ml,加H2O至400ml ，调pH至7.4)；0.5×SSC～0.1%SDS （20×SSC 5ml, 10%SDS 2ml, 加H2O至200ml，调pH至7.4）；0.1M柠檬酸钠(柠檬酸钠14.7g溶于450ml水，用浓HCl调pH至5.0, 最后定容至500ml)
1.3 p53基因特异性寡核苷酸(ASO)探针膜条制备过程
1.3.1 p53基因特异性寡核苷酸探针设计：应用Primer Premier5.0设计探针，氨基标记，探针序列分别为：NH2-5′-TGCTCCCCGCGTGGCCCCT-3′；NH2-5′-TGCTCCCCCCGTGGCCCCT-3′，由上海生工生物公司合成。
1.3.2 膜条制备：用打印机在硝酸纤维素膜上打印好标记格和编号。先用10%EDC（乙基二甲基氨基丙基碳二亚胺）浸泡膜条，充分处理10min，继用蒸馏水洗数次，然后把膜条摊在滤纸或吸水纸上晾干。待干透后,取1μlASO点膜，反应15min，再用0.1mol/L NaOH处理，晾干后保存备用。
1.4 标本来源：瘢痕疙瘩患者和正常对照人群均为浙江地区汉族居民。瘢痕疙瘩患者均经本院临床及病理诊断证实，共75例，其中男41例、女34例,年龄9～53岁，平均年龄26.8岁。本实验采用随机-对照研究, 正常对照组为有外伤史而非瘢痕体质且无瘢痕疙瘩家族史的健康居民, 共75例， 两匹配组间无血缘关系且无肿瘤病史, 其年龄、性别大致相同,用于基因检测的DNA全部来源于研究对象的外周静脉血，血样本用枸橼酸钠抗凝，置于-80℃保存备用。
1.5操作步骤
1.5.1 待测样品基因组DNA提取：采用北京赛百胜生物技术有限公司的基因组DNA提取试剂盒提取DNA。
1.5.2 PCR反应 用于扩增p53基因第72位密码子的引物5′端标记了非同位素检测介质Biotin,引物序列为：Bio-5′-GACCTGGTCCTCTGACTGCT-3′；Bio-5′-GATACGGCCAGGCATTGAAG-3′，由上海生工生物公司合成。反应在PE-480型扩增仪(美国PE公司)上进行。在50μl反应总体积中,含引物8.0pmol/L，DNA模板1μl，加入2UTaq酶(鼎国生物公司)。热循环参数：95℃热启动4min后，95℃1min，68℃2min，35个循环后，72℃延伸5min。取3μl扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，溴化乙锭染色,紫外透射仪下观察结果(图1)。
1.5.3 杂交：固化上寡核苷酸探针的膜条连同40μlPCR产物加入含5ml 2×SSC～0.1%SDS的试管中，100℃水浴变性7min，置杂交仪中42℃杂交3～6h；然后放入42℃预热的0.5×SSC～0.1%SDS中洗膜10min；将膜条转入含2.5U辣根过氧化物酶连链酶抗生素蛋白的10ml2×SSC～0.1%SDS试管中，室温反应15min；再用2×SSC～0.1%SDS洗膜5min×2次；最后，将膜条转入20ml显色液[19ml0.1mol/L柠檬酸钠(pH5.0)中加30%过氧化氢3μl和0.1mg/mlTMB]中避光显色5～15min,期间观察、记录结果。
1.5.4 结果判定：杂交结束后膜条上格显示蓝紫色斑点为Pro/Pro基因型，中格显示蓝紫色斑点为Arg/Arg基因型，而上、中全部显示为Pro/Arg基因型，下格为空白对照，不应显示斑点(图2)。
1.6统计学处理：应用SPSS10.0统计软件包处理数据。单个基因型及组间等位基因频率的比较采用χ2检验，以Ｐ＜0.05为差异有显著性意义,并以比值比(odds ratio,OR) 及其95%可信区间(confidenceinterval,CI) 表示相对风险度。
2结果
实验结果显示，瘢痕疙瘩组的Pro等位基因频率及Pro/Pro 基因型频率明显高于正常对照组(P值分别为0.014、0.015)。与Pro/Arg、 Arg/Arg基因型相比， Pro/Pro 基因型者患瘢痕疙瘩的相对风险性(OR)明显增高(OR=2.404,95%CI: 1.182～4.887)。
3讨论
3.1 瘢痕疙瘩在一定程度上具有肿瘤的生物学特性，如生长迅速、侵润正常组织和单纯切除后易复发等特点。故一旦发生处理相当棘手，提前预测其可能发生的风险率则可大大减少瘢痕疙瘩的发生，对其诊断和治疗方面也有重要的临床意义和实用价值。近年来，遗传因素在许多疾病的发生中所起的重要作用备受重视，且已发现了多种易感基因的存在。p53基因即是目前较为关注的与瘢痕疙瘩疾病相关的基因之一。人类ｐ53基因定位于17q13.1，长约20Kb，由11个外显子和10个内含子组成，编码393个氨基酸，p53蛋白在细胞周期的调控、维持细胞基因组的完整性，诱导细胞分化和凋亡中起着重要的作用[3-4]。近年研究发现p53基因第72位密码子Pro/Arg多态与某些肿瘤易感性有关。Fan[5]等报道携带Pro/Pro纯合基因型的美国白人患肺腺癌的风险增加1.45倍，Zehbe等[6]的研究证实Arg/Arg纯合基因型增加HPV感染宫颈癌的危险，最近, Kay等[7]报道p53 基因第72位密码子多态性与体外受精和胚胎植入成功率相关。
3.2 我们在前阶段发现p53基因第72密码子多态性与瘢痕疙瘩的发生存在关联关系，Pro/Pro 基因型者患瘢痕疙瘩的相对风险性明显增高[8]，并以此设计并装配成一套p53基因检测试剂盒用于预测瘢痕疙瘩高危个体[9]，为检验试剂盒的有效性,我们通过对浙江地区75例瘢痕疙瘩患者p53 基因第72位密码子多态性检测, 发现Pro/Pro 基因型人群患瘢痕疙瘩的危险度较Pro/Arg 型和Arg/Arg 型高, Pro/Pro 基因型者患瘢痕疙瘩的相对风险性(OR)明显增高(OR=2.404,95%CI: 1.182～4.887)。此结果与先前报道的结论大致相同[8], 我们认为此试剂盒可重复性良好、易于保存、操作过程既快速又经济, 适合在临床普及使用。
3.3 在检测过程中应注意的问题
3.3.1 杂交温度：反向点杂交的温度要求非常严格，应控制在42℃±0.5℃，否则就会影响杂交结果，杂交温度一般低于DNA的解链温度（T值）20℃～30℃，使用甲酰胺可降低T值，甲酰胺浓度增加1%，T值下降0.7℃,因此如果两种不同的探针同时杂交,可以考虑用甲酰胺来调整解链温度,使杂交顺利进行。
3.3.2 杂交液的体积和杂交时间：杂交体系的体积小比大好，小体积有利于增加核酸与膜上探针杂合的机会，但也不能太小，太小也会影响探针的分子运动，与杂交不利，通常使用体积应在60～100μl/cm2膜。对于杂交时间，3～24h不等，对于常用的杂交方法，往往取决于所用探针的浓度和强度，越高，杂交需要的时间越短，但过高的探针浓度既浪费又会使本底增高。本试剂盒所用的生物素标记的探针含量通常控制在20～1000ng/ml杂交液。
[参考文献]
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[收稿日期]2008-01-22[修回日期]2008-04-23
编辑/张惠娟