[摘要]目的：探讨血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及其Ⅰ型、Ⅱ型受体阻断剂和钙调神经磷酸激酶(CaN)的阻滞剂环胞素A(CsA)对增生性瘢痕来源的成纤维细胞纤维连接蛋白mRNA和蛋白表达的作用。方法：体外分离培养增生性瘢痕成纤维细胞，分别将一定浓度的Ang Ⅱ(10-9-10-5l/L)，和Ang Ⅱ 10-6mmol/L加上不同阻滞剂losartan、PD123319、环胞素A(浓度均为10-5mmol/L)加入细胞培养液中刺激48h，分别采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Westernblot印迹方法检测增生性瘢痕成纤维细胞纤维连接蛋白(FN)的mRNA及蛋白表达。结果：体外成功地培养增生性瘢痕成纤维细胞。经Ang Ⅱ刺激48h后，FN mRNA和蛋白表达量明显增高，增高程度与AngII浓度呈正比；加入losaartan和环胞素A后，FN原mRNA和蛋白表达量较单用AngⅡ组下降，而加入PD123319后，FNmRNA和蛋白表达量较单用AngⅡ组无明显改变。结论：Ang Ⅱ可促增生性瘢痕成纤维细胞的FN合成，可能在增生性瘢痕的发展过程中起重要作用，该作用主要通过AngⅡ的Ⅰ型受体介导完成，该作用可能与CaN信号通路有关。
[关键词]血管紧张素Ⅱ；逆转录聚合酶链反应；增生性瘢痕；成纤维细胞；纤维连接蛋白
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2007)04-0433-04
增生性瘢痕是以成纤维细胞过度增殖和细胞外基质过度沉积为主要特征的结缔组织疾病。其发病机制至今尚未彻底阐明。血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)作为肾素一血管紧张素系统中重要的因子，其经典作用是引起血管收缩和调节水盐平衡。近来研究认为，Ang Ⅱ作为一种生长因子，是一种强烈的促有丝分裂原，在促进心肌间质、肾脏间质、肺间质以及血管壁纤维化的过程中发挥重要作用。纤维连接蛋白(fibronectin，FN)为一种大分子非胶原糖蛋白，是细胞外基质的重要成分。本研究通过体外实验，观察Ang Ⅱ及其受体拮抗剂、CsA对成纤维细胞合成FN的影响。
1 材料和方法
1．1 主要试剂：Ang Ⅱ(美国Anaspec)；Losartan、PDl23319、csA(美国sigma)；大鼠抗人FN抗体(美国Neomarkers)；兔抗大鼠IgG(北京中杉)；DMFM培养基(美国Hyclone)；胎牛血清(美国Hyclone)；医用净化工作台(苏州净化设备公司YJ-875型)；CO2培养箱(美国SHEL―LABl815TC型)。
1．2 取材标准：①增生性瘢痕，瘢痕色泽红，质硬，高出皮肤表面，均为烧伤创面愈合已超过3个月，但瘢痕仍持续增生，瘢痕局部无感染和溃疡，均未曾使用抗瘢痕药物、弹力加压、放疗等方法治疗；②病人无高血压、肝硬化、肺纤维化、慢性肾炎、心肌梗塞等疾病；③病人无全身感染、肿瘤；④无结缔组织疾病或可能影响结缔组织代谢的疾病，未进行过全身应用皮质类固醇等药物治疗。
1．3 成纤维细胞分离、培养：采用组织块法进行原代培养，将手术中切下的符合条件的增生性瘢痕在无菌条件下切除其表皮，在少量胎牛血清中将标本切成1mm3左右的组织块置于培养瓶中，在95％空气、5％CO2、37℃、饱和湿度条件下培养6-8h，使组织块牢固的粘附在瓶壁上，然后加入含10％胎牛血清的DMEM培养基适量，继续培养，3-4天换液1次，2-3周后，原代细胞生长成单层，用0.25％胰蛋白酶消化后，按1:3的比例传代培养，此后每2-3天换液1次，每4～5天分种传代1次，实验用第3-5代细胞。
1．4 实验分组：实验分为四组：①对照组：10％胎牛血清的DMEM培养液；②Ang Ⅱ组：培养液中加入Ang Ⅱ，浓度范围(10-9 mol/L-10-5mol/L)；③Ang Ⅱ+洛沙坦(losartan)组：培养液中同时加入Ang Ⅱ(10-6mol/L)合losartan(10-5mol/L)；④Ang Ⅱ+PDl23319组：培养液中同时加入Ang Ⅱ(10-6mol/L)和PDl233 19(10-5mol/L)；⑤Ang Ⅱ+CsA组培养液中同时加入Ang Ⅱ(10-6mol/L)合CsA(10-5mol/L)。
1．5 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测FN的mRNA的表达：选取生长较好的成纤维细胞，采用Trizol法提取细胞的总RNA，用紫外分光光度仪测量总RNA的浓度和纯度，-80℃保存。按照试剂盒操作说明，根据FN的相应基因序列合成引物，逆转录为cDNA，PCR法扩增。FN的引物设计：上游引物序列：5’-GAT GTG ATG TCG ATT CCA T一3’下游引物序列：5’-GAT CT C TGG TCC ATG AAG AT-3’，扩增片段为1107bp。内参照β-actin引物上游序列5’-GTT GCG TTA CAC CCT TTC TTG ACA-3’，下游序列为：5’-GCA CGA AGG CTC ATC ATT CAAAA-3’，产物446bp。引物由北京华大基因合成。RT-PCR反应条件：94℃预变性3min，然后进入30个循环：94℃ lmin，57℃退火lmin，72℃lmin。循环完毕，72℃延伸7min。1.5％琼脂糖胶上电泳，紫外灯下观察结果并摄像。用凝胶图像分析系统对目的基因的PCR产物进行灰度测定，采用4.1版本Quantity One软件(Bio-Rad)分析各条带光密度值与内参片段的面积灰度比值，基因表达量以该比值来表示。
1．6 Western blot检测FN蛋白表达：细胞用SDS溶液裂解后，离心取上清。蛋白浓度采用BCA法测定。取50μg蛋白，经SDS-PAGE(12％分离胶，4％积层胶)分离后，采用半干电转方法将蛋白转移到PVDF膜上。用含有5％BSA的TBST封闭后，加入1:500稀释的抗AT1、AT2抗体和抗β-actin抗体于室温下孵育2h，随后加入1:300稀释的二抗于室温孵育1h，最后加入ECL试剂显影。采用4.1版本Ouantity One软件(Bio-Rad)分析各条带光密度值，β-actin蛋白表达作为内参照。
1．7 统计学处理：SPSS 10.0统计学软件分析。数据以(x±s)表示，进行t检验、相关分析及多个实验组 与同一对照组的比较的方差分析，P＜0.05有统计学意义。
2 结果
2．1 不同浓度Ang Ⅱ作用于成纤维细胞后FN的mRNA表达结果：总RNA在260和280nm波长下的吸光度比值大于1.8。甲醛变性提示mRNA表达完整，可用于半定量分析。AngII浓度为10-8mol/L时，FN的mRNA表达量开始增加，随着Ang Ⅱ加入浓度的提高，成纤维细胞FN的mRNA表达也随之增加，与对照组差异显著。
2．2 不同干扰因素与Ana Ⅱ共同作用于成纤维细胞后FN的mRNA表达结果：加用losartan后，成纤维细胞FN的mRNA表达较单用AngⅡ组表达下降，与对照组接近，加用CsA后，Ang Ⅱ mRNA表达也下降，但表达仍然高于对照组，加入PDl23319后对结果没有影响。
2．3 不同浓度Ang Ⅱ作用于成纤维细胞后FN的蛋白表达结果：Ang Ⅱ浓度为10-8mol/L时，FN蛋白的表达量开始增加，随着Ang Ⅱ加入浓度的提高成纤维细胞FN的蛋白表达也随之增加，与对照组差异显著。
2．4 不同干扰因素与Ang Ⅱ共同作用于成纤维细胞后FN的蛋白表达结果：加用losartan后，成纤维细胞FN的表达较单用Ang Ⅱ组表达下降，与对照组接近，加用CsA后，Ang Ⅱ mRNA表达也下降，但表达仍然高于对照组，但加入PD123319对结果没有影响。
3 讨论
FN是炎症条件下由成纤维细胞等分泌产生的细胞外基质成分，具有多种生物学功能，对介导细胞增殖和其他其他外基质成分的沉积以及在伤口愈合过程中起重要作用。有关文献报道，皮肤损伤后，伤口处沉积大量FN，诱导成纤维细胞、上皮细胞向伤口移动，并促进其增殖。此时的成纤维细胞、肌成纤维细胞和真皮内都含有丰富的FN。一旦上皮细胞再生完成、新生血管形成，成纤维细胞、上皮细胞和血管内皮细胞的FN随即消失。肉芽组织瘢痕化过程中，纤维化明显形成前组织中FN开始增多，当胶原增多、沉积形成紧密的束壮排列时，FN减少或消失。
肾素一血管紧张素系统(RAN)是机体调节血管张力和水钠代谢的内分泌系统的组成部分，随血液循环发挥作用。血管紧张素Ⅱ是RAS系统的主要活性成分。循环中的Ang Ⅱ主要来自肝脏，但研究发现局部组织也可自身合成分泌Ang Ⅱ。Stecklings等利用RT-PCR技术检测到血管紧张素原的mRNA在体外培养的原代角质形成细胞、黑素细胞、真皮成纤维细胞和真皮微血管内皮细胞上都有表达。Phillips等通过实验也得到相似的结果。Ang Ⅱ受体主要分为AT1、AT2两种亚型，AT1受体是一种膜受体，它具有激素受体的所有特征。它介导血管紧张素Ⅱ受体的大部分生理功能。Stecklings等通过RT-PCR检测出皮肤角质细胞、黑素细胞、真皮成纤维细胞及微血管内皮细胞均能表达AT1和AT2的mRNA。
目前，以Ang Ⅱ为主要因子的RAS在一些组织器官的纤维化过程中的重要作用正逐渐引起越来越多学者的关注。在纤维化过程中，局部组织的RAS激活，包括Ang Ⅱ在内的一些因子表达水平升高，表明局部RAS可能参与了组织器官纤维化和/或结构重构过程。这样的器官包括肝脏、肾脏、心脏、肺和皮肤。ACE抑制剂、Ang Ⅱ受体拮抗剂和阻断剂等可通过不同方式延缓和/或抑制器官纤维化的发生，进一步说明Ang Ⅱ有促器官纤维化的作用。增生性瘢痕是皮肤创面愈合后瘢痕持续增生的一种病理表现，其机制目前还不清楚。在皮肤组织中成纤维细胞占全部细胞数的40％-60％，是重要的修复细胞。成纤维细胞大量合成细胞外基质创伤修复中主要活动之一。已证明皮肤是Ang Ⅱ的靶器官之一，Ang Ⅱ能促进皮肤成纤维细胞的增殖和细胞外基质的沉积，提示Ang Ⅱ在人类瘢痕形成可能具有独特的作用。
在本实验中，来源于人增生性瘢痕的成纤维细胞受到浓度高于10-8mol/L的Ang Ⅱ刺激时FN的mRNA和蛋白表达均增加，且与Ang Ⅱ的浓度呈正相关。Ang Ⅱ的Ⅰ型受体拮抗剂losartan能几乎完全阻断该作用，Ang Ⅱ的Ⅱ型受体拮抗剂PDl23319对该作用几乎没有影响，提示AngⅡ的促成纤维细胞合成FN的作用主要是通过AT1受体介导的。环胞素A是钙调神经磷酸激酶(calcineurin，CaN)的阻滞剂，在Ang Ⅱ刺激时成纤维细胞时同时加入CsA后，FN的mRNA和蛋白表达均较单纯用Ang Ⅱ组下降，但依然高于对照组，提示CaN信号通路可能部分参与了Ang Ⅱ促成纤维细胞合成FN的过程。
综上所述，Ang Ⅱ参与创面愈合及促纤维化作用已经日益引起国内外学者的关注，我们的实验结果提示Ang Ⅱ能促进成纤维细胞合成细胞外基质的重要成分之一FN的合成。深层次探讨皮肤局部的RAS系统对创面修复及增生性瘢痕的作用，将有助于丰富创面修复的网络调控机制，为探索皮肤创面及瘢痕治疗方面探索新的途径。