[提要]目的：以肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）及其受体c-met蛋白为研究对象，研究其在人增生性瘢痕中的定位和表达。方法：采集住院患者的增生性瘢痕标本，以免疫组织化学染色的方法检测HGF/c-met在增生性瘢痕组织中的定位和表达，使用计算机辅助图像分析技术比较真皮层HGF/c-met表达水平的变化。 结果：在表皮层，增生性瘢痕组织和正常皮肤组织中的HGF/c-met均呈强阳性表达；相对于正常皮肤组织，人增生性瘢痕组织真皮层中HGF/c-met的表达明显增加，特别是在真皮层的成纤维细胞中，差异显著。结论：HGF/c-met在真皮层表达水平的改变可能是影响人增生性瘢痕形成的重要因素。
[关键词]增生性瘢痕；肝细胞生长因子；免疫组织化学。
[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2008）05-03
Experiment study of hepatocyte growth factor/c-met localization and expression in hypertrophic scar tissues
FENG Zhi,LI Shi-rong,CAO Chuan,WANG Zhen-xiang,CHEN Yan-qing,DAI Xia,XIA Shan
（Department of Plastic Surgery,Southwest Hospital,Third Millitary Medical University,Chongqing400038,China）
Abstract:ObjectiveHepatocyte growth factor（HGF） was investigated to study the localization and expression in hypertrophic scar tissues.MethodsAfter the hypertrophic scar tissues were obtained, immunohistochemistry was used to investgate the expression and location of HGF and c-met in pathologic sections. Computer-aid image analysis technology was used to detect quantitativly the change of the various protein expression.ResultsIn epidermis, HGF/c-met expression were intense staining.Compaired with normal skin tissues, HGF/c-met expression was up-regulated in hypertrophic scar tissues in dermic fibroblasts.ConlusionThe expression variance of HGF/c-met in derm could play an important role in the turnover of hypertrophic scar formation.
Key words：hypertrophic scar，hepatocyte growth factor，immunohistochemistry
增生性瘢痕( hypertrophic scar，HS) 是以成纤维细胞为主的细胞成分过度增殖和以胶原为主的细胞外基质过度沉积导致的皮肤纤维化疾病，目前其发病机制尚不清楚。肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）属于Kringle蛋白家族，由一对69Da的α链和34Da的β链经二硫键形成二聚体，通过与其受体c-met蛋白相结合，表现出多种生物学活性[1]。动物实验表明，HGF可以抑制肝脏TGF-β1的表达[2]，减弱小鼠肺纤维化模型中胶原的堆积[3]，改善伤口愈合后的形态结构[4]。
对多种纤维化类疾病的研究表明，血清中的HGF含量明显增加[5-6], c-met的表达还可以被HGF诱导增加[7]。但在人增生性瘢痕组织局部，HGF和c-met的表达是否改变至今仍不清楚。对此，本研究采用免疫组织化学染色的方法，结合计算机辅助图像分析技术，试图更详细地了解在增生性瘢痕组织中，HGF和c-met的定位及其表达的变化，为后续的研究奠定基础。
1材料和方法
1.1．主要材料和仪器：兔抗重组人HGF和兔抗人c-met多克隆抗体（武汉博士德公司），辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG SABC免疫试剂盒（武汉博士德公司），DAB显色试剂盒（武汉博士德公司），防脱玻片（Promega公司，美国），PBS及苏木精衬染液（自制），Olympus荧光显微镜（Olympus，日本），Image Pro Plus v6.0图像分析软件（ABsoft公司，美国）。
1.2．方法
1.2.1．标本的选择：选择5例临床诊断为增生性瘢痕的患者，相关标准参见李世荣主编的《现代整形美容外科学》，患者无系统性疾病，病程为伤后3～6个月，常规消毒后切取增生性瘢痕中央部位，另选择5例正常皮肤组织，来自于本科室手术患者供皮区全厚皮，标本大小均约1cm×1cm×0.5cm。
1.2.2．免疫组织化学SABC法染色：将上述标本即刻投入4%多聚甲醛中浸泡，48h后石蜡包埋并切片，贴片后微波修复，3% H2O2灭活内源性过氧化氢酶，加入羊血清封闭非特异性抗原，分别加入一抗（兔抗重组人HGF单克隆抗体和兔抗人c-met单克隆抗体，均稀释为1∶100）4℃过夜，依试剂盒说明书要求，加入二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG单克隆抗体，均稀释为1∶200），振洗后依次加入ABC复合剂、Tris-HCl缓冲液、底物显色液，并以苏木精染液行核衬染并封片；阳性对照选择已知表达HGF和c-met的肝细胞肝癌病理切片，阴性对照选择小牛血清。
1.2.3．计算机辅助图像分析：机型为Lenovo Sunrise 120笔记本电脑，显卡驱动为INTEL EXTREME GRAPHICS 6.14.10.3553版，操作系统为WindowsTMXPSP2。两位独立的研究人员检测阳性表达，每张切片随机选择3个真皮层视野，每组共计15个放大400倍的视野，依照Image-ProPlus v6.0图像分析软件的使用说明，分别测量各组真皮层细胞HGF和c-met阳性表达的累计光密度（Integrated optical density，IOD）。
1.2.4．统计方法：所用实验结果以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析，检验水准α=0.05，P＜0.05表示有统计学差异。
2结果
2.1 c-met的表达和定位：表达c-met蛋白的细胞胞浆被染为棕黄色。在表皮层，染色阳性的表皮细胞呈多角形，并和周围细胞相互嵌合，具有表皮细胞的形态特征。而在真皮层中，c-met染色阳性的细胞主要是成纤维细胞，呈梭形或不规则形；另外可在汗腺、毛囊上皮细胞和血管内皮细胞中看到阳性表达。正常皮肤和增生性瘢痕组织的c-met表达均主要位于表皮层，可见强阳性表达，而真皮层相对少；其中，正常皮肤组织真皮层几乎观察不到c-met表达阳性的细胞，而增生性瘢痕组织中，可见中等强度阳性表达的细胞。详见图1。
2.2 HGF的表达和定位：阳性HGF的细胞同样被染为棕黄色。HGF阳性表达的细胞和c-met阳性表达的细胞分布情况十分相似。正常皮肤和增生性瘢痕组织的HGF表达均主要位于表皮层，可见强阳性表达，而真皮层相对少；其中，正常皮肤组织真皮层几乎观察不到HGF阳性的细胞，而增生性瘢痕组织中，可见中等强度阳性表达的细胞。详见图2。
2.3 计算机辅助图像分析系统测量各组切片IOD的结果：使用Image-Pro Plus 6.0软件对两组切片真皮层HGF/c-met阳性表达的IOD进行分析，可以看到相比较于正常皮肤组，增生性瘢痕组织的HGF和c-met的表达均明显升高（P＜0.05），其中HGF的升高幅度更加明显，超过了7.5倍。各组的数据绘制统计表1。
3讨论
目前已知，HGF可在包括肝脏在内的多种器官广泛表达，通过与具有酪氨酸激酶活性的受体c-met蛋白结合，激活细胞内信号通路，发挥其促上皮细胞有丝分裂、运动变形、及形态塑构等多种生物学效应。皮肤组织中，HGF主要由表皮细胞和成纤维细胞合成、分泌，通过旁分泌和自分泌的方式作用于自身及临近的细胞。HGF对c-met的表达具有正反馈作用，即HGF可以刺激其受体c-met的表达。
近年来，众多的动物实验表明，HGF是一种关键的抗纤维化疾病的内源性生长因子[3-5，8-10]。哈小琴等[11]通过使用重组的腺病毒AD-HGF处理兔耳创伤模型，发现瘢痕增生明显减轻。Ono等[12]则发现HGF基因转染治疗创口，可以抑制成纤维细胞的凋亡、促进血管增生，进而改善瘢痕的组织形态。但是目前在增生性瘢痕病程的转归过程中，对组织局部微环境HGF/c-met的表达和定位仍缺乏了解。增生性瘢痕的主要特征是真皮结构的改变，其病理生理过程和成纤维细胞功能改变密切相关。本研究表明，和正常皮肤组织比较，在增生性瘢痕组织真皮层成纤维细胞HGF/c-met的表达均增强，其中，HGF的增强幅度更明显。HGF的表达受到多种因素的影响，包括IL-1、TNF-α、PDGF、EGF和缺氧等可以上调HGF的表达，而TGF-β1则可以下调HGF的表达；而c-met蛋白则可以被HGF、EGF、IL-1和甾体类激素诱导表达[13]。
考虑到HGF的多种生物学功能，这表明HGF通过结合受体c-met，在增生性瘢痕病程的转归过程中发挥着重要的生物学作用。但对于这一现象仍需要深入的研究，因为和上述文献动物实验不同，这种高表达HGF和c-met似乎并没有使标本供体的临床表现消失或减轻。对此，我们推测可能有多种原因，包括增生性瘢痕发生发展的复杂机制、HGF/c-met下游产物的生物活性和增生性瘢痕组织局部微环境的改变。此外，上述文献中动物模型的建立、HGF的作用剂量和途径等因素也有别于本研究所采集的临床标本，这些问题有待于更多的研究来揭示和证实。
总之，本研究的结果表明，HGF/c-met在增生性瘢痕和正常皮肤组织中均有表达，阳性细胞主要位于表皮层；而相比较与正常皮肤组织，在增生性瘢痕组织真皮层成纤维细胞表达HGF上调，并可能由此诱导其受体c-met表达升高。这种真皮层HGF/c-met表达水平的改变，提示了其在增生性瘢痕的疾病转归过程中可能发挥了重要作用。本研究为更好的了解HGF/c-met在增生性瘢痕中的作用打下了相应的基础，通过更加深入的研究，相信HGF/c-met可以为防治瘢痕类疾病带来新的研究方向和思路。
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[收稿日期]2008-02-23[修回日期]2008-05-06
编辑/张惠娟