[摘要]目的：探讨UVB照射对正常人黑素细胞PIG1细胞形态及增殖活性的影响。方法：取对数生长期的PIG1细胞，分别以50、100、200、300、400、500、600和700mJ/cm2剂量的UVB照射后继续培养0h、24h和48h，在倒置显微镜下观察其形态学变化，用MTT法检测UVB照射对细胞增殖活性的影响。结果：在50～200 mJ/cm2的UVB辐射下，随辐射剂量的增大，PIG1细胞的增殖活性逐渐增加，倒置相差显微镜从形态学上证实了一定剂量的UVB照射可以促进细胞增殖。结论：一定剂量的UVB照射有刺激PIG1细胞增殖及树突生长的作用。
[关键词]PIG1细胞；UVB照射；增殖；树突
[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2011）06-0944-03
Effect of UVB irradiation on the proliferation of PIG1 cells
ZHU Dong-ning,JIAN Qiang,XUE Ke,LIU Bo-qiang,WANG Ling,LI Cheng-xin
(Department of Dermatology,Xijing Hospital,The Fourth Military Medical University,Xi"an710032, Shaanxi,China)
Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of UVB irradiation on the proliferation of PIG1 cells.MethodsMorphology change of PIG1 cells was observed by light microscopy.MTT assay was used to record cellular activity.ResultsAfter UVB irradiation,the number of PIG1 cells was increased and the length of dendrites was extended. The proliferation activity of PIG1 cells was dependent on the irradiated dosages (50～200mJ/cm2).ConclusionsUVB irradiation can promote the proliferation activity of PIG1 cells and extend the dendrites of PIG1.
Key words:PIG1 cells; UVB irradiation; proliferation;dendrites
过量的紫外线照射可以导致皮肤灼伤、晒黑及免疫抑制，长期作用还可以引起皮肤光老化，并诱发皮肤癌[1-2]。紫外线辐射按波长不同分为UVA(315～400nm)、UVB(280～315nm)和UVC(100～280nm)。太阳辐射通过大气层时所有的UVC 和大约90%的UVB 能被臭氧、水汽、氧和二氧化碳吸收[3], 但是由于地球上方臭氧空洞的形成及增大, 大气层对UVB 的吸收减弱, 导致到达地球表面的UVB 的量迅速增加, 因此UVB对生物体损伤的机制及其防护的研究具有理论和实际意义[4-5]。目前，关于UVB照射对PIG1细胞增殖影响的研究多集中在采用单一或少数几组照射剂量，在照射后24h观察细胞增殖活性的变化[5-7]。本实验采用一组均匀递增的照射剂量，分别在照射后24h及48h时检测细胞的增殖活性，并在倒置显微镜下观察细胞形态的变化，以测定不同剂量UVB照射对PIG1细胞增殖活性的影响，以进一步探讨UVB照射与PIG1细胞增殖活性间时效与量效的关系。
1材料和方法
1.1主要试剂：254培养基购自Cascade Biologics公司，标准胎牛血清购自GibcoBRL公司，HMGS添加剂购自Cascade Biologics公司，胰蛋白酶、噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）均购自Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养与接种：永生化的人表皮黑素细胞系PIG1来自美国艾利诺斯州Loyola医学中心。用含有5%胎牛血清的254培养基常规培养。取对数生长期的PIG1细胞消化后以2×104/ml的密度接种于96孔板，用于细胞活性检测。接种后的PIG1细胞培养至80%融合度时接受UVB照射。
1.2.2 UVB照射方法及能量密度的选择：实验使用上海希格玛公司生产的紫外线光疗仪，辐照度以UVB辐照度监示器标定,UVB剂量=UVB辐照度×时间(s)。由于254培养液可吸收一定的光量子而引起误差，因此每次照射前吸去培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗1次后，96孔板每孔中加入100μl PBS。分别选用0、50、100、200、300、400、500、600和700mJ/cm2照射。照射后吸去PBS重新加入254培养基，培养至24h及48h检测细胞活性。
1.2.3 MTT法检测细胞活性：取接受不同能量照射后的PIG1细胞进行MTT比色试验，每孔加入20μl 5mg/m1的MTT溶液终止培养，在CO2孵箱中继续培养4h后吸去培养液,再每孔加入150μl DMSO,充分振荡培养板10min，酶标仪在490nm波长下测定各孔吸光度值（A 值）,用DMSO空白孔校零，计算细胞存活率（%）＝UVB照射组A490/空白对照组A490×100%。
1.2.4倒置相差显微镜观察细胞形态学变化：以剂量0、50、100、200、300、400、500、600和700mJ/cm2UVB辐射细胞，在照射后0h、24h和48h以倒置显微镜观察细胞的形态变化。
1.2.5 数据统计分析：实验数据用x±s表示，照射组与对照组及照射组间比较采用SPSS12.0进行单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05时认为差异有统计学意义。
2结果
2.1 UVB照射对PIG1细胞活性的影响：用不同能量（0、50、100、200、300、400、500、600和700mJ/cm2）的UVB照射PIG1细胞,观察24h时的细胞增殖活性（图1）。照射能量在50、100mJ/cm2时，细胞增殖活性高于照射前水平（P＜0.05），50mJ/cm2时细胞增殖活性最强；而照射能量高于200mJ/cm2时，细胞增殖活性低于照射前水平，并随着能量升高呈逐渐下降趋势。
观察用上述能量的UVB照射PIG1细胞后48h时的细胞增殖活性（图2）。照射能量在100mJ/cm2时细胞活性有一定程度的恢复，而到400mJ/cm2后呈下降趋势。100mJ/cm2时的细胞增殖活性较24h升高，200 mJ/cm2时细胞活性达最大值，而24h则从200mJ/cm2时开始下降。
2.2 UVB照射对PIG1细胞形态的影响：选择能稳定增加PIG1活性的能量100mJ/cm2照射后48h，光学显微镜下观察细胞的形态变化（图3）。A、B图分别是未照射组及照射组照射后即刻的细胞状态，细胞生长状态相似；D图为100mJ/cm2 UVB照射PIG1后48h，相对于培养至48h的未照射组（C图）细胞数量明显增多，树突显著延长。
3讨论
3.1 紫外线是电磁波谱中波长从0.01～0.40μm辐射的总称。它是一种外源性的促细胞分裂剂，黑素细胞膜上有光受体，紫外线照射能引起黑素细胞的增殖及黑素生成，导致黑素沉着。皮肤的色素沉着主要由UVB引起，UVB的生物学效应强度是UVA 的800～1000倍，是引起皮肤光损伤的最重要波段[8]。本研究采用UVB光源，以PIG1细胞为辐射细胞，进行光损伤方面的研究。
3.2 实验检测不同能量UVB照射对PIG1细胞活性的影响时，选用0、50、100、200、300、400、500、600和700mJ/cm2进行照射，选择这组均匀递增的能量在照射后24h及48h时检测细胞活性，能够较好的反映出UVB照射与PIG1细胞增殖活性间时效与量效的关系。在24h时，细胞活性在50mJ/cm2时开始上升，200mJ/cm2时低于照射前水平，并随着能量升高呈下降趋势。以上提示PIG1细胞可以耐受一定能量范围内的照射，当UVB照射能量增强到某个值时PIG1细胞才会被损伤。而在48h时，细胞活性在100mJ/cm2时有一定程度的恢复，而到400mJ/cm2后呈下降趋势。这可能与细胞可以清除自身光损伤产物这一性质有关。通过UVB照射对PIG1细胞活性影响的时效性分析我们发现：UVB照射能量100mJ/cm2时能够较稳定增加细胞活性。提示一定剂量的UVB照射有刺激PIG1细胞增殖的作用。而选择超过100mJ/cm2的能量照射时，PIG1细胞的活性受到抑制。而这种抑制作用并不是持续性的，细胞活性会在一段时间后恢复，因此在这种情况下UVB对PIG1细胞表现出的损伤作用是可逆性的。
3.3 由于UVB照射能量在100mJ/cm2时能够较稳定增加细胞活性，因此选择100mJ/cm2UVB照射PIG1后48h 观察了细胞形态的变化。光学显微镜观察结果示PIG1细胞相对于未照射组数目明显增加，树突明显延长增多。提示UVB照射有刺激树突生长的作用。这在形态上进一步证实了一定剂量的UVB可促进PIG1细胞的增殖。
3.4 人体皮肤的色素沉着过程非常重要，它不仅决定皮肤、眼睛和头发的颜色，还可以保护皮肤免受紫外线的过度照射。该过程不仅包括黑素合成，黑素小体向角质形成细胞内的传递也起到了非常重要的作用，为确保黑素小体的运动与传递，有效的树突形成是必须的前提条件[9-10]。一定剂量的UVB照射可以促进PIG1细胞的增殖，并可以促进树突的生长，这就为黑素小体向角质形成细胞的传递提供了形态学上的条件。本研究从体外初步观察了UVB照射对PIG1细胞增殖的影响，为研究紫外线照射与皮肤色素沉着的关系提供了依据。UVB照射对色素沉着过程中黑素合成及转运的影响有待于进一步地研究。
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[收稿日期]2011-03-29[修回日期]2011-05-18
编辑/张惠娟
注：“本文中所涉及到的图表、公式、注解等请以PDF格式阅读”