刘雪梅 [摘要]目的：了解骨髓基质干细胞(MSCs)复合纳米羟基磷灰石／聚乳酸(n―HA／PLA)构建组织工程骨的异位成骨作用。方法：选择6只新西兰白兔，实验组于动物脊柱左侧肌肉内植入MSCs复合n―HA／PLA构建的组织工程骨，对照组于右侧植入n―HA／PLA生物材料。术后4、8周取材，行溴脱氧尿嘧啶(Brdu)标记细胞检测和组织学观察。结果：术后4周，实验组材料边缘均可检测到Brdu标记的MSCs。术后4、8周，实验组材料内部有新骨形成，随着时间推移，新骨量增多，编织骨向板层骨过渡。对照组材料未见新骨形成。结论：MSCs复合n―HA／PLA构建的组织工程骨具有很好的异位成骨作用。
[关键词]骨髓基质干细胞；纳米羟基磷灰石；聚乳酸；组织工程
[中图分类号]Q813 [文献标识码]A [文章编号]1008―6455(2007)01―0025－03
目前对骨组织工程支架材料的研究很多，但尚未找到，种理想的材料。单一类型的支架材料存在各自的优缺点，仅靠单一材料很难满足骨组织工程支架材料的要求。理想的骨组织工程支架材料的制备应考虑到无机陶瓷类材料、合成聚合物材料和天然生物衍生材料的优缺点，将有机材料和无机材料通过合适的方法组合成复合材料，模拟天然骨基质组成成分，通过促进种子细胞的粘附、增殖和分化，从而发挥最佳的成骨能力。纳米羟基磷灰石／聚乳酸(n―HA／PLA)就是根据这一原理将无机材料纳米羟基磷灰石与有机材料聚乳酸通过特殊工艺聚合而成的新型生物材料，本实验旨在研究复合生物材料n―HA／PLA作为组织工程支架材料的可行性。
1 材料和方法
1．1 MSCs的分离培养与诱导：取健康新西兰白兔2只，双侧胫骨结节处备皮消毒，无菌条件下用骨穿针穿刺抽取红骨髓8ml，加入含肝素的DMEM培养液(Gibco公司)，混匀后加入3ml淋巴细胞分离液(Gibco公司)，1800r／min离心10min，吸除中间层细胞后再离心，所得细胞沉淀以1×106／ml密度接种于含15％胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养。待细胞相互融合达90％生长面积时用0．25％胰蛋白酶(Sigma公司)消化传代培养。细胞传至3代时，移入含10～8mol／L地塞米松、50mg/L维生素C和10～2mol／Lβ－磷酸甘油钠的DMEM培养液诱导培养3天，诱导后的细胞表型经鉴定为成骨样细胞。移入含0．2％BrdU的无血清培养液(按200μl BrdU／100ml DMEM培养液的比例配制)中，于37℃、5％C02饱和湿度条件下培养1h标记细胞。
1．2组织工程骨的制备：n-HA／PLA由美国印第安那大学医学院生物工程研究室提供，材料规格为１5mm×10mm×5mm大小，环氧乙烷消毒后备用。将n-HA／PLA支架材料用DMEM培养液浸泡1天后弃残液，每个支架材料以1×106／ml密度接种经诱导培养的MSCs，于37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养3天。术前清晨更换不含青霉素和链霉素的无血清培养液。
1．3动物模型和实验分组：6只新西兰白兔全身麻醉，常规消毒颈背部，于脊柱棘突两侧各作长约2cm切口，依次切开皮肤和皮下组织，显露肌组织，分开肌间隙，将移植材料植入肌腹内，逐层缝合切口。实验动物自身作对照，于动物脊柱左侧肌肉内植入组织工程骨，右侧植入单纯支架材料。
1．4 检测项目
1．4．1大体观察：术后观察动物饮食、活动，伤口有无肿胀、分泌物等。术后4周处死动物，取出移植材料，观察移植物的颜色、质地和血管形成，与周围软组织分布情况。
1．4．2 BrdU标记细胞检测：术后4周部分标本经4％多聚甲醛固定1周后，乙醇梯度脱水。有机树脂包埋，硬组织切片机制作厚度为5μm切片标本，用免疫组化的方法检测标记细胞。切片标本用0．3％H2O2一甲醇处理30min灭活内源性氧化酶，5％正常兔血清封闭，甲酰胺100℃变性核酸5min，冰浴冷却后PBS洗涤，加工作浓度为1：50的小鼠BrdU单克隆抗体。阴性对照以PBS代替一抗。显微镜下观察，细胞核内棕色颗粒为阳性细胞。
1．4．3组织学观察：标本经4％多聚甲醛固定，用10％EDTA脱钙，常规脱水、浸蜡和包埋，石蜡切片厚度5μm，行HE染色，显微镜下观察植入材料内新骨形成的情况。
2 结果
2．1大体标本观察：术后8周，各组植入材料周围软组织未见坏死、化脓、积液等现象，可见各组材料有大量纤维组织和血管等软组织包裹和长入，很难将其分离。
2．2 BrdU标记细胞检测：将BrdU标记的MSCs与n-HA／PLA支架材料复合物植入动物体内，术后4周取出标本，免疫组化方法检测标记细胞，支架材料边缘可检测到BrdU标记的MSCs(图1)，MSCs呈阳性反应，阳性物质为棕黄色细颗粒，分布于MSCs细胞内，阴性对照中细胞内和细胞外基质未见阳性信号。
2．3组织学观察结果：术后4周，实验组标本可见有软骨带形成，其中有少量钙化的骨组织，周围可见梭形的间充质细胞向软骨细胞分化(图2)。术后8周，实验组标本可见有编织骨形成，并可见髓腔形成，其内见有岛状骨小梁，周边仍可见软骨细胞。随植入时间的延长，组织工程骨逐渐被降解吸收，且新骨或软骨形成增多，并有血管、纤维组织、脂肪、肌肉组织长入材料间隙内。术后4周和8周，对照组植入的生物材料中未见任何软骨或新骨形成，随着植入时间的延长，材料逐渐被降解吸收，可见周围的肌肉组织、纤维组织和血管等由外向内逐渐长入材料孔隙内(图3)。
3 讨论
羟基磷灰石(hydroapatite，HA)作为骨修复材料最大缺点是生物力学强度明显低于正常骨，这就决定了HA只能作为充填材料，不适用于负重骨缺损的修复。同时HA移植修复骨缺损，在新骨形成和材料降解吸收的过程中，新骨不能完全恢复至HA移植前的形态，形成的新骨量具有不可预测性。因此HA不适用于负重骨缺损的修复，或是对外形要求很高的颌面外科修复。将无机材料纳米羟基磷灰石与有机材料聚乳酸通过特殊工艺聚合而成的新型生物材料n-HA／PLA，其形态、结构和成分与人体骨中磷灰石晶体结构相似。与普通HA相比较，n-HA／PLA具有良好的骨传导性、骨诱导性和生物相容性，并且其生物力学强度，特别是抗压、抗折弯和弹性模量与人体皮质骨相近。n-HA／PLA的主要矿物相为低结晶度和纳米量级含碳酸根的羟基磷灰石，与入骨的天然成分相同，因此n-HA／PLA具有良好的组织亲和性和结合力。研究表明骨替代材 料相互连通的孔隙是新骨形成的先决条件：100～500μm的孔径有利于成骨细胞黏附生长、爬行替代和牛物矿化过程；孔径在40～100μm之间，只能产生类骨质；孔径小于40μm，则只能产生肉芽组织。本实验采用的n-HA／PLA生物材料网孔平均孔径为300μm，孔隙率为80％，具有三维立体网状孔隙系统，仿生生物骨的骨小梁、小梁间隙和骨内管腔结构，这种结构有利于种子细胞的粘附和生长，并可为细胞外基质的分泌提供宽大表面积和内部空间。本实验中MSCs在n-HA／PLA支架材料上黏附、增殖、分化良好，表明n-HA／PLA是一种较好的骨组织工程支架材料。
异位成骨是指在肌肉等非骨组织内成骨，正位成骨是指在骨膜下或骨组织内成骨。由于异位成骨具有正位成骨的所有形态结构和代谢特性，排除正位骨化由于受体骨或骨膜成骨的假阳性结果，容易解释新骨形成的细胞来源，则研究结果更为真实可信L6)。本实验将BrdU标记的MSCs复合n-HA／PLA构建组织工程骨植入动物肌肉内进行异位成骨的研究。BrdU与脱氧尿嘧啶结构相似，BrdU能在细胞周期S期专一掺入DNA，且BrdU单克隆抗体不与胸腺嘧啶发生交叉反应，故BrdU标记细胞具有很高的准确性和安全性，现已广泛地应用于细胞动力学研究中。BrdU标记细胞一般在体内8周可检测到，最长不超过12周。本研究结果表明，将Br-dU标记的MSCs与n-HA／PLA支架材料复合物植入动物体内，术后4周取出标本，免疫组化方法检测标记细胞，实验组材料边缘均可检测到BrdU标记的MSCs，阴性对照中细胞内和细胞外基质未见阳性信号。以上结果说明组织工程骨的种子细胞在宿主体内存活、生长、增殖和分化，分泌含有骨形态发生蛋白、转化生长因子β等骨源性生长因子的基质，诱导结缔组织中的间充质细胞、骨髓基质细胞或滑膜细胞向软骨细胞或成骨细胞分化，通过膜内化骨或软骨内化骨形成新骨；骨源性生长因子通过细胞间的信号传导趋化破骨细胞的聚集，降解并吸收材料以促进更多的新生骨形成。本研究结果表明，没有复合MSCs的生物材料未见任何软骨或骨组织形成，而组织工程骨均有软骨或骨组织形成，说明单纯的生物材料只起支架作用，组织工程骨异位成骨的细胞来源于MSCs，表明构建组织工程骨复合种子细胞是必需的。本研究中还发现，组织工程骨体内植入后先有软骨形成，后经形态发生形成骨组织，进一步表明支架材料复合MSCs体内成骨是通过软骨化成骨，其�能机制是MSCs先分化生成软骨组织，而支架材料降解后释放的钙则沉积于软骨基质以促进软骨钙化形成骨组织。
编辑／张惠娟
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