石河子 大学 “ 国家大学生创新性实验计划 ”
项目申请表
项目名称 E-选择素基因 G98T 多态性与新疆汉族慢性乙型肝炎及 DNA 载量的研究 项目负责人
陈慧园
学院、年级、专业 医学院 2007 级医学检验 联系电话
15886937223
电子邮件
Chengjiang1980-@163.com 填表日期
2009 年 10 月 17 日
石河子大学教务处制表
项目名称 E-选择素基因 G98T 多态性与新疆汉族慢性乙型肝炎及 DNA 载量的研究 申请经费 5.0 万元 起止时间 2010 年 1 月至 2011 年 12 月 负责人 姓 名 学号 所在学院及专业 联系电话 E-mail 分 工
陈慧园 2007144138 医学院医学检验 15886937223
实验设计 参加成员 卢香云 2007144162 医学院医学检验 15026243987
样本采集 王旭辉 2007144143 医学院医学检验 15899293698
临床检测 于媛媛 2007144160 医学院医学检验 0993-2318358
样本分析 张 晶 2007144166 医学院医学检验 13279930827
统计分析 指导教师 姓 名 职务/职称 所在学院及研究方向 联系电话 E-mail 签 字 程 江 主任技师 副教授 医学院，临床分子生物学 13709931715 Chengjiang1980_@163.com
一、
项目申请理由 （项目的研究背景、现状及研究目的、意义等）
慢性乙型肝炎是我国常见的慢性传染病之一，严重危害人民健康。其病原体是乙型肝炎病毒 (HBV)病毒。HBV 感染呈世界性流行，但不同地区 HBV 感染的流行强度差异很大。据世界卫生组织报道，全球约 20 亿人曾感染过 HBV，其中 3.5 亿人为慢性 HBV 感染者，每年约有 100 万人死于 HBV 感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。新疆幅员辽阔，人员流动频繁，据统计，约有 10%至 15%为慢性乙型肝炎患者，患病率和发病率均较高，已成为非常严重的社会问题。慢性乙型肝炎作为一种由遗传、机体免疫和环境因素共同作用所致的复杂的感染性疾病，遗传因素在慢性乙型肝炎中起着重要作用。已经有资料显示，一些细胞因子如肿瘤坏死因子、白细胞介素基因多态性与慢性乙型肝炎的作用已经逐渐明了。但是 E-选择素是近几年新发现的一种炎症细胞因子，在肝脏中过高表达可以介导炎性细胞和免疫细胞的浸润，其血清学水平在慢性乙型肝炎的作用已经被证实，但是其基因多态性与慢性乙型肝炎的相关性研究，与乙肝病毒复制情况的相关性研究少见报道。人类 E-选择素基因位于第 1 号染色体长臂,为一段长 13kb 的 DNA 序列,含 14 个外显子和 13 个内含子。E-selectin 分子量为115KD，定位于活化的内皮细胞表面。E-选择素表达具有瞬时性及特异性。E-选择素仅表达在内皮细胞上, 静息时其含量甚微,当内皮细胞被 IL-1、LPS 和 TNF-α等细胞因子激活后,E-选择素的表达大大增加, 2～4h 达最高峰,24h 降解。E-selectin 有介导活化的内皮细胞与中性粒细胞粘附作用,此外，还可介导内皮细胞与单核细胞、记忆 T 细胞、嗜酸、嗜碱性粒细胞、树突状淋巴细胞、前 T 细胞、成人 T 细胞性白血病细胞等的结合。E-selectin 介导的粘附作用既不依赖于白细胞的活化，也不需要白细胞整合素的参与。内皮上的 E-selectin 可选定白细胞，继而介导其活化，因而有助于白细胞稳定地粘附于内皮细胞，继而迁移至血管外组织。E-selectin 是诱导性粘附
分子，在炎症刺激或组织损伤过程中,最早的反应是白细胞沿着损伤部位的血管壁滚动。这种滚动行为是由 Selectin 家族介导的,是白细胞与内皮细胞粘附以及穿越血管壁的先决条件。
E-selectin 参与介导滚动,但由于它的生成是在转录水平,所以 E-selectin 在炎症极早期白细胞的粘附聚集中作用甚微。现已普遍认为:白细胞在肿瘤坏死因子-a、细菌脂多糖、白介素-1 等刺激后的内皮细胞表面的粘附、聚集，继为渗出，是通过E-selectin、细胞间粘附分子-1 及血管细胞粘附分子-1 等分别在不同的阶段起主要作用，共同介导的。
G98T 多态性是 E-选择素基因第 2 外显子 5′非翻译区 98 位点(转录起始位点下游第98bp)G 突变为 T 造成的单核苷酸多态性。而 E-选择素 5′非翻译区结构存在多个顺式和反式作用元件,包括启动子、NF-κB 结合位点等。这一多态性发生的部位并不翻译成蛋白质,而是通过对基因表达的调控,影响 E-选择素在内皮细胞上的表达。这是以内皮细胞的损伤为基础的,而 E-选择素介导的黏附聚集又是造成内皮损伤的前提。即G98T 多态性突变可通过影响 E-选择素 5′非翻译区结构增强了表达 E-选择素的功能,造成了黏附作用的增强,进而引起炎症反应,最终损伤内皮细胞。E-selectin 作为细胞因子网络中一种具有多种生物效应的重要生理炎性介质，在血液中的升高程度将反应出血管内皮损伤的情况。HBV 感染的结果在很大程度上取决于被感染者本身，即使同民族、性别及年龄相似的个体经同一方式感染相同的病毒亚型，也会产生不同的结果。
大量的流行病学提示，慢性乙型肝炎的发生发展与感染性炎症及细胞因子间的网络调控有一定的关系。E-选择素作为一种炎症细胞因子，参与多种白细胞（包括粒细胞，巨噬细胞，单核细胞等）以及 CD4+记忆性 T 细胞亚群的黏附聚集并刺激白细胞与内皮
细胞的相互作用。已经有研究表面可溶性 E-选择素的表达增加与慢性乙型肝炎的炎症情况有关，可溶性 E-选择素水平的变化反映了细胞表面成分的翻转和蛋白质的水解，可作为疾病活动的标志。张淑兰等的研究显示，中国河北地区汉族人群存在 E-选择素A561C 基因多态性，与慢性乙型肝炎的发生和病毒复制水平有一定的相关性，这说明E-选择素在慢性乙型肝炎的发病机制中起着重要的作用。分子生物学研究表明，E-selectin G98T 存在基因多态性，与慢性乙型肝炎是否存在相关性，目前尚未见报道。因此，本课题拟研究新疆汉族慢性乙型肝炎患者 E-selectin G98T 基因多态性和HBV 载量的关系，试图从分子遗传学角度探讨 E-selectin G98T 基因多态性与慢性乙型肝炎的相关性，为揭示慢性乙型肝炎的发病机制提供新的理论。
这一基因多态性的突变频率不仅有明显的种族差异,而且也存在显著的地区差异。研究我国人群的 E-选择素基因多态性,不仅为进一步研究我国汉族人群中慢性乙型肝炎的发生发展与 E-选择素基因多态性间的关系提供理论依据,也将有助于更深入地理解慢性乙型肝炎在不同地区间所具有的不同发病率和临床特点的基因背景。当然,也不排除这一基因突变仅在某些特定人群起作用的可能性。
主要参考文献：
1.韦叶生，李艳，张平安. 湖北地区汉族人群 E-选择素表皮生长样区 A561C 基因多态性的研究. 检验医学，2004，19：18-20 . 2.韦叶生，李艳，张平安，等. E-选择素第 2 外显子 G98T 基因多态性与高血压的相关性研究. 山东医药，2003，43：14-15. 3.Rauchhaus M，Gross M，Schulz S，et al . The E-selectin SER128ARG gene polymorphism and restenosis after Successful coronary angioplasty . Int Cardiol，2002，83：249-257 .
4.Ellsworth DL，Bielak LF，Turner ST，et al . Gender-and age-dependent relationships between the E-selectin S128R polymorphism and coronary artery calcification. J Mol Med，2001，79：390-398 . 5.Essani NA , McGuire GM , Manning AM , et al. Endotoxin induced activation of the nuclear transcription factor kappa B and expression of E-selectin messenger RNA in hepatocytes , Kupffer cells , and endothelial cells in vivo. J Immunol ,1996 ,156 : 2956-2963. 6.病毒性肝炎防治方案. 中华传染病杂志,2001,19:56-62. 7.金伯泉,主编. 细胞和分子免疫学. 西安: 世界图书出版社,1999. 8.Kaplanski G, Farnarier C , Payan MJ , et al. Increased levels of soluble adhesion molecules in the serum of patients with hepatitis C. Correlation with cytokine concentration and liver inflammation and fibrosis. Dig Dis Sci , 1997 ,42 :2277-2284. 9. 冯忠军,张淑兰,张金华, 慢性乙型肝炎患者 E-选择素 A561C 基因多态性的研究,河北医药，2006：28（1）11-13 10. 闫明先 刘倩 王文奇等，可溶性 E-选择素与慢性乙型肝炎的关系，中华传染病杂志，2003，21（5）：342-343 11.张淑兰，魏晨玲，冯忠军， E-选择素 A561C 基因多态性与慢性乙型肝炎和 HBV-DNA载量的相关分析，检验医学，2006，21，（5）524-527
二、 项目研究内容 （研究的主要内容、基本思路和方法、重点难点、主要观点和创新之处）
（一）研究内容: 1.通过 E-选择素基因水平的探索，可初步了解新疆汉族人群 E-选择素G98T 基因频率分布。
2．E-选择素基因 G98T 多态性与慢性乙肝的相关性研究尚未见报道。本课题拟拟对新疆汉族慢性乙型肝炎患者进行 E-选择素 G98T 多态性的检测，探索新疆汉族慢性乙肝患者的发病特点，为诊断和治疗提供参考依据。
3.将 E-选择素 G98T 基因型与 HBV-DNA 载量合并研究，探寻其相关性。
（二）研究方法 1.流行病学调查设计：
(1)研究对象：研究对象来自石河子大学医学院第一附属医院门诊和住院病人，所有研究对象在抽血前回答流行病学调查问卷，并签署知情同意书。
(2)质量控制：为确保资料的完整性、可靠性、准确性，同时考虑到质量控制在本次课题中的重要性，建立了严格的质量控制标准。主要采取的质量控制措施如下：严格执行流行病学现场标准化操作规程，所有调查员均经过专门的培训，进行问卷调查和记录流行病学调查资料。资料收集后进行整理、检错及录入工作，并经过审核无误后方可入库。
(3)入选标准：所有病例选择均符合 2000 年在西安召开的中华医学会传染病与寄生虫病学分会制定的《病毒性肝炎防治方案》中的诊断标准 ，并排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒标志阳性，排除混合（重叠）感染。
所有病例均除外心、脑、肾、肺等器官疾病及高血压、糖尿病等对本研究有潜在影响的疾病。
(4)健康对照组：均为健康体检者，排除肝脏、肾脏、内分泌和心脑血管疾病者。
(5)血液标本的采集：抽取空腹静脉血 5ml，置于肝素抗凝的高压消毒的真空离心管中,离心 10min,取上清血浆,在全自动生化分析仪上检测血糖、血脂等常规生化指标。用 ELISA 法检测乙肝三对半，用流式细胞仪法检测外周血 HBV-DNA 的含量。
(6)E-选择素基因 G98T 多态性位点检测:抽取空腹静脉血 5ml 全血，用EDTA 抗凝，-80℃保存，PCR-RFLP 技术进行多态性位点检测，具体步骤如下：
全血标本→基因组 DNA 提取→PCR 扩增→琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物→限制性内切酶 HphI 酶切扩增产物→琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物→随机抽取样本进行测序，检验基因型的一致性。
(7) 统计学分析：基因型和等位基因频率采用直接计数法，研究对象与Hardy-Weinberg 平衡的符合程度、单个基因型及组间等位基因频率比较采用四格表 X2 检验和 R × C 列联表 X 2 检验。判断因素与疾病间是否存在联系采用 Woolf 法，以比值比（OR）及其 95%可信区间（CI）表示相对风险度。计量资料用 X± s 表示，各组间数据的比较采用 t 检验，P < 0 .05 为有统计学意义。
（三）重点和难点：收集病例上可能有困难，计划与临床联系，期望得到他们的帮助和支持，完成问卷调查和标本采集。
（四）主要观点和创新点: (1)目前国内无 E-选择素基因多态性与新疆汉族慢性乙型肝炎的相关研究报道。
(2)将 E-选择素基因型和 HBV-DNA 载量相结合进行研究,论证其与新疆汉族慢性乙型肝炎的关系。
(3)探寻新疆汉族 E-选择素基因 G98T 基因多态性的分布。
（五）技术路线:
统计学分析
记录年龄、身高、体重、血压等指标
采集样本，进行流行病学调查，质量控制，标本的采集与保存 问卷调查，记录流行病学资料并分析 PCR-RFLP法检测E-选择素G98T 的基因多态性
提取基因组 DNA，扩增目的片段，琼脂糖凝胶电泳，
HphI 酶切，基因分型 全 自 动 临床 生 化 分析 仪 检 测外 周 血 血糖、血脂、肝 功 能 等生化指标 病例组（150 例）
对照组（150 例）
按入选和排除标准合理选择标本并分组 分析 E-选择素基因多态性与新疆汉族慢性乙型肝炎的关系， 研究 E-选择素基因多态性和外周血 HBV-DNA 载量的关系。
流式细胞仪法检测外周 血HBV-DNA 的含量 ELISA法检测患者乙肝三对半
三、项目创新特色概述 (50 字以内) 探寻新疆汉族E-选择素基因G98T基因多态性和外周血HBV-DNA载量与新疆汉族慢性乙型肝炎的关系 。
四 、项目进度安排 （查阅资料、选题、自主设计项目研究方案、开题报告、实验研究、数据统计、处理与分析、研制开发、填写结题表、撰写研究论文和总结报告、参加结题答辩和成果推广等）
研究工作阶段 主要研究内容 起止日期 查询资料 查阅国内外文献， 完成问卷及标本的收集 2010.1-2010.6 确定课题 撰写综述、确定课题题目 2010.7-2010.9 设计方案、开题报告 制作幻灯、准备开题报告 2010.9-2010.10 试验分析、数据统计与分析 检测病例和对照组人群中 E-选择素基因 G98T 多态性和 DNA 载量，分析 E-选择素基因多态性与新疆汉族慢性乙型肝炎的相关性 2010.11-2011.6 论文撰写 资料整理，统计分析，发表文章 2011.7-2011.9 结题、撰写论文 撰写论著 2011.10-2011.11 结题答辩 结题答辩 2011.12
五、拟利用资源 （实验室、设备、资料等）
1.实验拟在新疆地方与民族高发病教育部重点实验室、石河子大学医学院第一附属医院检验科和石河子大学医学院第一附属医院医学实验室完成，这三个实验室均为省（部）级重点实验室，拥有完善的实验设备和条件，保证本课题的顺利进行。
2.拟用的主要设备和仪器有：PCR 仪、流式细胞仪、酶联免疫分析仪、全自动临床生化分析仪等。
3.需要查阅的主要资料包括：相关国内外的最新进展、实验室安全使用条例和操作规程等
六、 项目经费预算与用途（购置实验材料、试剂、药品、加工测试、资料、复印、调研、交通等经费开支）
开支项目名称 金
额 1.购置实验材料 6000 元 2.购买试剂、药品 12000 元 3.加工测试、资料、复印 11000 元 4.调研、项目实施费用 2000 元 5.PCR-RFLP 实验试剂 16000 元 6.常规生化指标检测费 2000 元 7.交通费等 1000 元 合
计 50000 元
七、 项目预期成果 （研究论文、设计、调研报告、申请专利、开发软件、研制产品、项目鉴定等）
1.通过 E-选择素基因多态性和新疆汉族慢性乙型肝炎的相关性研究，探讨其发病特点，为预防发病及减少并发症奠定基础，进一步为临床判断新疆汉族慢性乙型肝炎的易感性及预后提供指导。
2.预期得到实验数据和统计学分析结果，结题前在国内核心期刊上发表文章 1-3 篇。
八、 项目诚信承诺
本项目负责人和全体成员慎重承诺，该项目研究不抄袭他人成果，不弄虚作假，先诚实做人，再诚信做学门和研究，按项目研究进度保质保量完成各项研究任务。
项目负责人签名：
项目组成员签名：
2009 年 10 月 17 日
2009 年 10 月 17 日
九、 指导教师意见 （从项目学科性、前沿性、可行性、研究性、可操作性和成效性加以评价）
该课题拟就 E-选择素 G98T 基因多态性与新疆汉族慢性乙型肝炎及 DNA 载量的关系，试图从分子遗传学角度探讨新疆汉族 G98T 基因多态性的分布及规律，为揭示新疆汉族慢性乙型肝炎的发病机制提供参考依据。选题有较强的可行性，有一定的研究意义，同意推荐。
签
名：
2009 年 10 月 17 日
十 、学院意见
学院负责人签名盖章：
年
月
日 十 一 、学校意见
签名盖章：
年
月
日