[摘要]目的：探讨引导大鼠下颌前伸后，髁突软骨中血管内皮细胞生长因子受体Ⅱ(KDR/F1K-1)表达水平的变化。方法：50只35天龄雄性SD大鼠随机分为5组，每组随机分为实验组(5只)和对照组(5只)；实验组大鼠24h佩戴自制功能性矫治器引导下颌前伸；实验后3、7、14、21和30天分别处死各组大鼠；免疫组化方法检测髁突软骨中FIK-1的表达情况。结果：对照组髁突软骨F1K-1表达随时间延长而减弱，后部区域F1K-1表达强于前部和中部；实验后第14天，21天和30天实验组F1k-1表达强于相应对照组(P＜0.05)，21天时其增强幅度最大。结论：下颌前伸后大鼠髁突软骨细胞F1k-1表达增强，说明其介导了VEGF引发的软骨内骨化过程。
[关键词]功能性矫治；血管内皮细胞生长因子受体Ⅱ(KDR/F1k-1)；下颌前伸
[中图分类号]Q813.1 R782.13 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2007)04-0440-03
临床上利用功能性矫治器引导下颌骨前伸可促进髁突软骨的生长代谢，增加下颌骨长度，从而达到矫治Ⅱ类错牙合的目的。研究发现下颌前伸可以诱导髁突组织中新骨形成增加；软骨细胞表达VEGF，从而诱导新生血管形成，被认为是骨取代软骨的标志。
VEGF的生物学功能是通过其特异性受体发挥的。VEGF的受体主要有三种：VEGFR-1(fms-like-tyrosine kinase，F1t-i)，VEGFR-2(kinase insertdomain-containing receptor/fetal liver kinase，KDR/F1k-1)和VEGFR-3(F1t-4)。F1t-1合KDR/F1k-1两者都是VEGF高特异性的受体，F1t-4在淋巴管的生成中发挥主要作用；其中F1k-l是VEGF最重要的受体，具有强烈的酪氨酸激酶活性，是VEGF诱导内皮细胞增殖的主要调节剂，在下颌髁突软骨内骨化过程中血管和破骨细胞侵入软骨过程中发挥了重要的作用。所以了解下颌前伸后髁突软骨F1k-i表达变化的规律，对于评价VEGF在功能矫形前伸下颌后髁突组织改建过程中的作用具有十分重要的意义。
1 材料和方法
1．1 实验动物的选择与分组：35天龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(第四军医大学动物实验中心提供)50只，根据实验周期(3、7、14、21和30天)分为5组，每组内随机分为实验组和对照组。
1．2 实验方法
1．2．1 咬合前导装置：参照Rabie等方法，上颌斜面导板由甲基丙烯酸甲酯材料制成，包括斜面导板和固位装置组成；其中固位装置包括板内固位钩、口外链状橡皮圈、防护颈圈。
1．2．2 操作方法：速眠新Ⅱ(0.3-0.8ml/kg)(长春农牧大学兽医研究所)腹腔注射麻醉。利用粘结材料将斜面导板粘固于上切牙，通过固位钩将链状橡皮圈经鼻上颌复合体与防护颈圈连接，使得斜面导板获得稳定的固位，防护颈圈能够有效地防止大鼠前爪对装置的破坏及对面部组织的伤害。
实验组动物佩戴上颌斜面导板式功能矫治器，每天持续佩戴24h，对照组动物不戴。所有动物都以软食饲养，自由饮水，同环境下饲养至实验结束。
1．2．3 组织处理：五组动物分别在实验后3、7、14、2l和30天处死，深度麻醉下经主动脉插管灌注0.1mol/L的PBS缓冲液(200ml/只)，40g/L多聚甲醛(400ml/只)；充分暴露颧弓，整块取出双侧颞下颌关节；40g/L多聚甲醛中固定24h：Kristense液中脱钙1周，常规脱水；石蜡包埋时注意调整暴露的颧弓表面直至其与蜡块的上表面平行，髁突纵向切片厚5μm。
1．2．4 免疫组织化学染色：按免疫组化ABC法常规实验步骤，对组织切片进行F1k-1免疫组织化学染色。兔抗F1k-1多克隆抗体(1:50)购自博士德生物试剂公司，SABC免疫组化试剂盒为博士德生物试剂公司产品。空白对照：用PBS代替一抗。
1．2．5 图像分析：Olympus CX31型光学显微镜下应用Pixera PVC100C系统采图，各组切片采集100倍图像，Photoshop8.0软件选取TMJ髁突软骨前、中、后部进行观测，每部分选择连续3个64px×64px大小的区域，计数各区域棕色深染的阳性细胞数。
1．3 统计分析：SPSS11.5统计软件，实验组与对照组组间比较用t检验，对照组各时间点的组内比较用方差分析，P＜0.05为有统计学差异。
2 结果
F1k-1阳性细胞胞浆着色为棕黄色，着色水平明显高于背景水平。空白对照(PBS代替一抗)组未见阳性着色颗粒。
2．1 F1k-1在大鼠髁突软骨中的分布：F1k-1在髁突软骨中主要在成熟层和肥大层表达，增殖层未见表达，表现为软骨细胞胞浆和胞膜着色，DAB显色为棕黄色；纤维层中未见表达。
2．2 F1k-1在髁突软骨前部的表达：对照组中F1k-1的表达呈现出增龄性变化，随着观测时间点向后推移，表达F1k-1的阳性细胞数减少(P＜0.01)，到达21天以后趋于平稳；实验组中F1k-1的表达在21天组和30天组要强于对照组(P＜0.05)。
2．3 F1k-1在髁突软骨中部的表达：下颌前伸导致了实验组髁突软骨中部F1k-1的表达增强；实验后第3天和第7天F1k-l表达与对照组相比未见明显差异(P＞0.05)；实验后第14天，21天和30天F1k-1表达较相应的对照组明显增强(P＜0.01)。
2．4 F1k-1在髁突软骨后部的表达：同一观测时间点内髁突软骨的后部F1k-1的表达比中部和前部要强烈(P＜0.05)；下颌前伸后髁突软骨后部在第3天和第7天F1k一1表达与对照组相比未见明显差异(P＞0.05)；实验后第14天，21天和30天F1k-1表达较相应的对照组明显增强(P＜0.01)，其中21天时实验组F1k―1的表达较对照组增强的幅度最大。
3 讨论
在骨骼生长和更新的过程中血管生成对于骨取代软骨过程是必不可少的。通常认为软骨是一种无血管组织，并且合成血管发生抑制剂，然而近来有研究表明软骨下的血管内皮细胞与软骨细胞的生长和分化密切相关。这些结果证明了软骨细胞分化和内皮细胞侵袭二者之间存在着共存并相互制衡的关系，其共同导致了软骨内骨化过程的发生。VEGF由肥大软骨细胞合成分泌并释放到其周围的介质中，对内皮细胞具有强趋化性。
F1k-1是VEGF的主要功能受体，其主要分布于内皮细胞表面，VEGF对内皮细胞的促进生长、增殖、分化等作用主要是由F1k-1介导的。F1k-1和VEGF结合后发生二聚体化，胞内的酪氨酸残基自身磷酸化。VEGF的单克隆抗体可以阻断VEGF诱导的血管通透性增加和VEGF与F1k-l的相互作用，却不能阻断VEGF与F1t-1的相互作用，表明F1k-1在调节VEGF诱导的血管通透性增加中起主要作用。VEGF受体的活化导致了蛋白酶的产生，而这正是血管发生的第一阶段中血管组织基底膜分解、血管发生所需的特殊整合素的表达以及细胞增殖和迁移所必需的。
本实验观测了大鼠下颌前伸过程中F1k-l的表达变化并将其与自然生长状况下的表达情况进行了比较。结果显示F1k-1主要表达于髁突软骨的成熟层和肥大层，对照组中F1k-1在髁突后部区域的表达要强于中部和前部，这表明VEGF在软骨后部区域作用更加广泛，而这种作用是通过其特异性受体F1k-1来发挥的。
本实验中，通过对5个时间点对照组F1k-1表达情况的比较发现，F1k-1表达量逐渐减少，这可能是由于大鼠由生长期过渡到成年期这一过程中大鼠髁突组织生长、改建速度减缓而分泌活动减弱所造成的。下颌前伸后关节盘受到牵拉，软骨细胞周围机械力发生变化引起细胞反应增强，进而导致软骨细胞增加F1k-l的表达，VEGF则通过F1k-1发挥作用，促进软骨内骨化进程。F1k-1的表达在髁突软骨后部区域增强的更为明显，这可能是由于下颌前伸后髁突软骨主要承力区由中部转移为后部，后部软骨细胞受到的机械力刺激增加，导致其细胞功能增加更为明显，进而表达F1k-1的量增加的幅度更大，其在21天时实验组后部区域F1k-1表达量增强最大，可能是下颌前伸过程中表达增强的VEGF诱导其特异性受体F1k-1表达增强造成的。F1k-1表达的增强意味着其所介导的软骨下骨形成增加，这也表明后部区域比中部及前部生长更为明显。