王正辉 综述 杨壮群 贺西京 审校 软骨组织存在于机体的许多部位，透明软骨是软骨的主要形式，普遍存在于骨骼系统中，如胚胎时期的骨生成始基、幼年个体发育期引导骨增长的生长板以及关节的骨软骨负重面等。所有的透明软骨都含有大量的特征性物质蛋白聚糖（proteoglycan,PG），它主要以透明质酸和连接蛋白合成的蛋白聚糖聚合物形式存在，在软骨中通过其渗透性使软骨膨胀以抵抗软骨所受的压缩力。自20世纪80年代中期以来，蛋白聚糖在软骨损伤中的降解机制就一直为研究的热点[1]。
1蛋白聚糖的结构与功能
1.1 蛋白聚糖聚合物：蛋白聚糖聚合物(aggrecan)是一种有多个功能域的模板蛋白聚糖，其核心蛋白有三个球形区域，由G1、G2、G3组成，每个域都含有半胱氨酸残基并以氢键连接，G1和G2由球间域分隔，G2和G3间有糖胺聚糖(GAG)附着区，其中富含硫酸软骨素(CS)和硫酸角质素(KS)。G1位于核心蛋白的氨基端，可分为三个功能域A、B1、B2，B型域和透明质酸（HA）有交互作用；G2也有两种B型域，但与HA无相互作用，目前其功能尚不明确；G3位于核心蛋白的羧基端，含有多种特殊结构域，它对于蛋白聚糖核心蛋白正常的翻译后加工及后续的蛋白聚糖分泌作用是不可少的。GAG附着区由三个可附着CS和KS的域组成。
蛋白聚糖分子并非孤立地存在于细胞外基质中，而是以aggrecan形式存在［2］。每个aggrecan都由位于中心的透明质酸链和其发出的100个蛋白聚糖分子组成，相互之间以连接蛋白连接加以稳固。巨大的aggrecan分子在组织中被胶原支架包裹从而使蛋白聚糖稳定于胞外基质中［2］。软骨中aggrecan很少以完整的形式存在，取而代之的是受细胞外蛋白酶解加工的核心蛋白，最终产生的aggrecan不是完整的蛋白聚糖分子［3］。参与aggrecan代谢的生物大分子很多，降解代谢最重要的两种酶是基质金属蛋白酶(MMPs)和多聚蛋白聚糖酶(aggrecanaes)[4]，而合成代谢中最重要的是组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)[5]和α2巨球蛋白[6]。这四种生物大分子之间的相互作用和制约维持着PG的代谢平衡。
蛋白聚糖基因突变导致的软骨发育不全在人类已有报道，在人的外显子12处插入单个碱基对会引起移码，造成一种脊柱骨骺发育不良[7]。这些病症表明蛋白聚糖的含量对胚胎软骨的发育和生长起重要作用。
1.2 连接蛋白：连接蛋白(link protein，LP)结构类似于蛋白聚糖的G1区域，具有A、B1和B2域，是蛋白聚糖家族成员。其中A1和G1相互作用，B2 则与HA相互作用[10]。完整的人类软骨连接蛋白以两种分子形式存在（LP1、LP2），区别在于其氨基末端分别有2个或1个N-连接寡糖链。
哺乳动物有4个连接蛋白基因，其中有一个主要在软骨内表达，每个LP基因都与一个透明质酸基因相邻，但它并不与临近的必需基因共表达，因为软骨的LP基因和蛋白聚糖基因不相毗邻。软骨的LP在aggrecan中有多种功能：①与蛋白聚糖的HA和G1域相互作用来维持蛋白聚糖的稳定性，预防蛋白聚糖的降解；②参与一种“迟缓聚合”现象，因新近分泌的蛋白聚糖不和HA发生作用，而是通过其G1区的由LP介导的一种构象变化来促进聚集体的形成；③LP和G1域共同形成一种蛋白质外壳，覆盖于HA表面保护HA免受透明质酸酶和自由基作用而发生降解。
1.3 HA：HA是一种以较大的长度及独特的合成模式为特征的未硫酸化的GAG,通过透明质酸合酶(HAS)而分布于细胞膜上[8]，哺乳动物有三种HAS（HAS1、HAS2、HAS3），各自位于染色体的不同部位。HA由于它独特的合成物模式而被挤出细胞核，作为外壳分布于软骨细胞周边，而蛋白聚糖最初可能也位于此处，至于蛋白聚糖聚合物是如何从此处被释放并移至胞外基质目前尚不清楚。软骨中HA随着年龄的增长其体积逐渐减小而含量逐渐增多[8]。
HAS1、HAS2、HAS3都在软骨内表达，有研究显示人软骨细胞在生长因子和细胞活素的作用下呈现不同的表达规律，其中HAS2表达水平最高，HAS3表达水平最低。最近对软骨HAS2 敲除小鼠的研究表明：软骨HAS2基因的缺失表达会导致严重的骨骼异常及围产期死亡[9]，这揭示了HA和aggrecan在维持正常软骨功能及软骨分化和软骨内骨化中的重要作用，也表明了在软骨HAS1或HAS3的表达不能够补偿HAS2的缺乏。
1.4 SLRPs：SLRPs属于富含亮氨酸的蛋白质大家族，依据基因的组构、亮氨酸重复序列的数量及GAG链结构的类型而分为多个子家族 ，如核心蛋白聚糖、二聚糖、纤维调节素及具有10个亮氨酸重复序列的光蛋白聚糖。已有研究报道核心蛋白聚糖和纤维调节素在体外被MMPs 降解，而该降解在体内也可能发生[8]。纤维调节素和光蛋白聚糖作用于胶原分子的相同区域，该区域与核心蛋白聚糖的作用位点不同，核心蛋白聚糖的作用涉及亮氨酸重复序列中的氨基酸序列。GAG链和多种生长因子相互作用使SLERPs在细胞外基质中为生长因子提供场所。该研究还显示SLRPs通过调节细胞中的生长因子来调节软骨细胞的代谢[9]。SLRPs的合成水平随年龄而变化，其含量随年龄变化的确切机制尚不明确，但其产物的缺失能影响组织特性这一点是毋庸置疑的。核心蛋白聚糖的缺乏会导致邻近纤维组织的融合，胶原纤维的形态不规则；二聚糖缺乏会导致类骨质疏松症表型，动物生长率下降和骨量减少。该研究明确表明SLRPs不足会引起组织中胶原纤维结构的破坏，且每种蛋白聚糖都有其特异性的异常表型[9]。
2蛋白聚糖与骨关节病
2.1 大骨节病(KBD)：KBD主要病理改变是四肢透明软骨的变性坏死，其蛋白聚糖代谢存在明显异常。研究发现KBD病区水中的致病因子促使猴软骨GAG分子低硫酸化，这种代谢异常与KBD软骨组织的病理形态学改变密切相关。颜炜群等[10]观察了KBD患者血清对培养软骨细胞PG代谢的影响，实验结果表明KBD患者血清中存在干扰PG代谢的因子，可致PG合成能力明显下降，分解代谢增加，以致软骨中PG含量减少，在结构上呈现出低硫酸化、低分子量和缺乏HA结合区，不能与HA结合形成aggrecan。这些研究结果提示aggrecan的分子损害是KBD的一个非常重要的特征[10]。
2.2 骨关节炎(osteoarthritis ,OA)：OA 时PG结构组成和分布发生明显变化[11]，首先PG聚合程度明显降低，aggrecan比例减少，其完整性遭到破坏，可分解为不同大小的片断。GAG变化表现为KS含量减少，CS含量相对增多；结构也发生变化，硫酸化程度下降，HA进行性耗竭，预示aggrecan形成能力下降。OA时关节各部位的PG变化也不一致，最早、最典型的变化在负重区，在同一部位则最早变化于软骨表层，正常时软骨表层有较多量与表面平行排列的胶原，PG减少和水合增加改变了基质的离子组成使胶原松散，并且PG与胶原的交联率也减少。胶原结构的破坏使位于其间的PG暴露，易于裂解并引起免疫反应。OA时首先发生PG降解，检测体液的PG降解产物为早期诊断提供了依据。PG在细胞粘附、细胞间交流、信息传递以及细胞增殖和分化等多方面扮演了重要角色，它的降解在OA发生、发展中起到了关键性的作用。
3蛋白聚糖与软骨移植
软骨移植的组织来源主要以自体、同种异体和异种软骨移植物为主。其中，同种异体移植软骨为仅次于自体软骨的良好生物材料，其成本低、来源广泛且生物学性能良好的优点，使其目前在临床上应用较多，效果良好，临床成功率可达90％以上[12]。在正常情况下，蛋白聚糖的合成与分解保持动态平衡，这种平衡有利于维持软骨基质结构与功能的完整性[13]。致病因素所导致aggrecan的丢失可以视为软骨代谢失衡的始动环节，如持续存在，则引起关节软骨胶原纤维的降解和各种炎性信息因子的释放，引发瀑布效应，进而彻底打破关节软骨的代谢平衡，使其进入不可逆性的负代谢状态，导致细胞外基质屏障破坏，最终导致软骨的吸收。
研究发现同种异体软骨移植后软骨ECM大量衰退，尤其在移植后一个月内最为明显，表现为基质中蛋白聚糖含量发生较大的变化[14]。移植前的软骨细胞不表达主要组织相容性抗原，移植后一个月左右开始表达，并逐渐增强[15]。最终导致软骨吸收、降解，影响手术远期效果。因此，研究蛋白聚糖在软骨移植中的降解机制无疑对移
植手术的术后效果是很重要的。
4蛋白聚糖与软骨组织工程
软骨组织工程是应用工程学和生命科学的原理和方法, 将种子细胞与生物载体材料(即支架)复合后进行培养,在体内形成具有生理功能的软骨组织，替代和恢复病变软骨组织的功能。因此，种子细胞的选择、培养和软骨细胞支架材料的研究两个环节在软骨组织工程中显得尤为重要。软骨细胞是常用的种子细胞，随着培养时间的延长和传代次数的增多，软骨细胞的特异性表型Ⅱ胶原和aggrecan逐渐减少，影响软骨的形成[16]。因此蛋白聚糖已成为检测软骨组织工程的重要指标[16-17]。
5展望
软骨蛋白聚糖作为软骨基质的关键组成部分，在维持软骨的生理功能方面发挥了重要的作用。软骨移植后的首要变化就是蛋白聚糖的丢失，在KBD、OA等关节疾病领域对蛋白聚糖的降解已有了较为深入的研究，但尚未见用于软骨移植研究的报道。因此借鉴骨关节疾病中关节软骨基质蛋白聚糖代谢的研究方法，进一步探讨软骨代谢改变在软骨移植后及软骨组织工程的作用，将对软骨移植机制的阐明及预防软骨的丢失和减少排斥反应有重要的意义。因此如何维持蛋白聚糖的稳定性，从而保持细胞外基质的免疫屏障作用，减少异体软骨的排斥反应及吸收，将是我们进一步研究的内容。
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[收稿日期]2007-08-10 [修回日期]2007-10-24
编辑/李阳利