[摘要]目的:体外构建研究色素问题的黑素瘤细胞(A375)与角质形成细胞(HACAT)直接接触的共培养模型,利用熊果苷对此共培养体系进行验证。方法:MEM培养基分别培养A375细胞与HACAT细胞,A375细胞与HACAT以1:2的比例共培养,构建黑素瘤细胞与角质形成细胞直接接触的共培养模型;将不同浓度熊果苷作用于此模型,用MTT法、多巴氧化法及NaOH裂解法检测熊果苷对细胞增殖、酪氨酸酶活性以及黑素合成的影响。结果:A375细胞与HACAT能共同存活,1.0mg/ml、0.5mg/ml和0.2mg/ml熊果苷对共培养细胞的增殖、黑素细胞酪氨酸酶活性及黑素合成均有较强的剂量相关的抑制作用,与对照组相比差异有统计学意义(P 1.2.2分组及给药:实验分给药组、阴性对照组和空白组。给药组熊果苷的浓度分别0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mg/ml;阴性对照组直接加培养基;空白组不加细胞,只加培养基。以空白孔调零,各组设6个复孔。
1.2.2细胞增殖活性测定:将混合后的细胞用含10%FBS和1%双抗的MEM培养基调整细胞浓度为1.5×104个/ml,按每孔200μl接种至96孔板,5%CO2,37℃培养箱培养8～12h。细胞贴壁后换含不同浓度熊果苷的培养液,继续培养48h。培养结束前4h加5mg/ml的MTT 20μl,继续培养4h后,倒扣法去除培养液,每孔加入150μl DMSO,将培养板置于微孔板震荡器震荡10min,使结晶溶解。酶标仪490nm测定吸光度值。细胞增殖活性用A490值表示。
1.2.3 酪氨酸酶活性测定:将混合后细胞浓度调整为1.5×104个/ml,按每孔200μl接种至96孔板培养24h后弃培养基,换含不同浓度熊果苷的培养液,继续培养48h。用pH7.4的0.01M的PBS洗涤2次,每孔加1%Triton-X溶液100μl,迅速置-80℃冰箱内放置30min后,之后室温下融化,充分裂解细胞。37℃预热,加入0.5%L-DOPA溶液50μl/孔,于37℃下反应3h,以490nm波长测定各孔OD值,每个浓度设6个复孔,每一处理因素重复3次。酪氨酸酶活性用A490值表示。
1.2.4 黑素含量的测定:采用Hunt[7]法测定黑素量。共培养细胞以4.5×104/ml,接种6孔板,每孔2ml(约90 000个细胞),置于培养箱中培养24h后,给药组用含不同浓度熊果苷的新鲜培养液换液1次,对照组只加培养基;继续培养48h后,吸弃培养液,加入0.25%胰酶0.5ml/孔消化后,加入1mlMEM中止消化,制成细胞悬液,将细胞悬液收集到10ml离心管中,1 500r/min离心5min,弃去上清液,然后加入100μl浓度为1mol/L NaOH,37℃水浴lh,充分裂解细胞和溶解黑素颗粒。加入400μl双蒸水释稀,充分混匀后,100μl/孔分别加至96孔板,置酶标仪测OD值,波长为490nm。每一处理因素重复3次。黑素含量用A490值表示。
1.3 统计分析:所测数据采用SPSS16.0统计软件包进行统计,各处理组与对照组多重比较用方差分析。
2结果
2.1 黑素瘤细胞与角质形成细胞混合培养:Hacat细胞与A375细胞可共同存活,A375细胞呈梭形、双极、三极或多分支树突状。Hacat细胞呈近似菱形,簇集成团。如图1。
2.2 熊果苷对共培养细胞增殖率、酪氨酸酶活性及黑素含量的影响:见表1。
由表1可见,熊果苷浓度≥0.2mg/ml时,对共培养细胞的增殖有显著抑制作用,与阴性对照组比较,差异具有统计学意义(P